Моноклональные антитела серии ИКО в трехцветном анализе субпопуляций Т-лимфоцитов периферической крови онкологических больных

Введение. Клинические исследования показали, что у большинства онкологических больных наблюдаются нарушения иммунологической реактивности. Мониторинг состояния иммунной системы больных с солидными опухолями включает субпопуляционный анализ иммунокомпетентных клеток (ИКК), основанный на изучении экспрессии поверхностных антигенов и внутриклеточных структур, и анализ функциональной активности ИКК. В настоящее время для субпопуляционного анализа лимфоцитов человека используют двух-, трех- и даже четырехцветные реакции иммунофлуоресценции (РИФ), позволяющие одновременно определять в одном образце несколько различных антигенов. Для этого используют сбалансированные смеси («коктейли») иммунофлуоресцентных зондов (ИФЗ) различной антигенной специфичности, несущих разную флуоресцентную метку. В ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России путем конъюгирования моноклональных антител (МКА) серии ИКО и флуоресцентных красителей – флуоресцеина в форме изотиоцианатного эфира (FITC), моносукцинимидного эфира Alexa-488, цианиновых производных Imd306, Imd506 и растительного белка группы фикобилипротеинов фикоэритрина (PE) получены и охарактеризованы лабораторные образцы ИФЗ. Исследования этих конъюгатов показали их пригодность для одно- и двухцветного анализа субпопуляций лимфоцитов периферической крови человека методом проточной цитометрии.

Цель исследования – оценить возможность совместного использования нескольких ИФЗ на основе различных МКА серии ИКО и красителей FITC, Imd306, Imd506 и PE для трехцветного анализа субпопопуляций лимфоцитов здоровых людей и пациентов с онкологическими заболеваниями методом проточной цитометрии.

Материалы и методы. В работе использовали панель ИФЗ, включающую зонды CD3-FITC, CD4-PE, CD8-Imd506, CD4-Imd306, полученные конъюгированием МКА серии ИКО разной специфичности и флуорофоров FITC, PE, Imd306 и Imd506 соответственно. Специфическую активность зондов оценивали в монохромных, двух- и трехцветных РИФ методом проточной цитометрии. Для оптимизации состава смесей ИФЗ и условий постановки РИФ в качестве исследуемого биологического материала использовали образцы венозной крови практически здоровых доноров. Клиническую апробацию полученных «коктейлей» проводили на 2 группах пациентов с онкологическими заболеваниями до и после хирургического лечения. Первая группа включала 64 больных раком слизистой оболочки полости рта. Вторая группа – 35 больных раком яичников.

Результаты. Показано, что для трехцветного анализа лимфоцитов человека методом проточной цитометрии рекомендуется использовать наборы меченых МКА: CD3-FITC (10 мкг/мл) + CD4-Imd306 с концентрацией 5–10 мкг/мл; CD3-FITC + CD4-PE с концентрацией 20 мкг/мл и CD3-FITC + CD8 Imd506 с концентрацией 10 мкг/мл. Указана конечная концентрация иммуноглобулина в растворе ИФЗ. Показано, что еще до начала лечения у больных раком слизистой оболочки полости рта в структуре Т-клеток статистически достоверно снижено содержание CD3+CD4+, а общий уровень CD8+ лимфоцитов достоверно превышает показатели донорской группы. Анализ линейных маркеров, характеризующих основную структуру лимфоидных клеток у первичных больных раком яичников, позволил выявить статистически значимое снижение по сравнению с показателями у доноров общего количества СD3+ Т-лимфоцитов. Не выявлено влияния проведенного хирургического лечения на показатели субпопуляционной структуры лимфоидных клеток.

Заключение. Комбинации флуоресцентных зондов CD3-FITC/CD4-Imd306/CD8-Imd506 и CD3-FITC/CD4-PE/CD8-Imd506 могут использоваться для трехцветного анализа методом проточной цитометрии субпопуляций лимфоцитов как практически здоровых доноров, так и онкологических больных. Сравнительные исследования специфической активности комбинаций ИФЗ на основе МКА серии ИКО и референтных коммерческих тест-систем (BD Biosciences) на лимфоцитах здоровых доноров и онкологических больных (рак яичников, рак слизистой оболочки полости рта) показали сопоставимые результаты. Применение полученных зондов позволило выявить нарушения субпопуляционной структуры лимфоцитов периферической крови у больных раком яичников и раком слизистой оболочки полости рта, в частности CD3 – /CD8+, CD3+/CD4+, CD3+.

1. Галактионов В.Г. Иммунология: учебник. М.: Издательство МГУ, 1998:480 с.

2. Артамонова Е.В. Роль иммунофено типирования опухолевых клеток в диагностике и прогнозе рака молочной железы: дис. … д-ра мед. наук: 14.01.12. М., 2003:311 с.

3. Борунова А.А., Чкадуа Г.З., Заботина Т.Н., Кадагидзе З.Г. Изучение субпопуляции CD16+ лимфоцитов у онкологических больных на фоне вакцинотерапии. Медицинская иммунология 2006;8(2–3):334.

4. Борунова А.А., Чкадуа Г.З., Заботина Т.Н., Демидов Л.В. Иммунофенотип лимфоцитов больных меланомой на фоне вакцинотерапии. Российский биотерапевтический журнал 2005;4(1):8.

5. Заботина Т.Н., Очеева Н.Ю., Короткова О.В. и др. Оценка функциональной активности клеток гранулоцитарно-макрофагального звена иммунитета больных раком слизистой оболочки полости рта. Мат-лы VI съезда онкологов и радиологов стран СНГ: тез. докл. Душанбе, 2010. С. 67–8.

6. Заботина Т.Н., Короткова О.В., Борунова А.А. и др. Субпопуляционная структура лимфоцитов у больных раком яичников. Вестн. РОНЦ им. Н.Н. Блохина 2010;21(1):46–51.

7. Кадагидзе З.Г., Славина Е.Г., Заботина Т.Н. и др. Иммунологический профиль лимфоцитов крови у онкологических больных. Российский биотерапевтический журнал 2013;12(2):38.

8. Кадагидзе З.Г., Черткова А.И., Заботина Т.Н. и др. Основные субпопуляции регуляторных лимфоцитов у больных злокачественной меланомой и раком молочной железы. Иммунология 2014;35(2):64–7.

9. Коровушкина К.А., Бабаев А.А., Котельникова Т.В. и др. Оценка состояния иммунитета при опухолях тела матки. Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского 2010;2–2:653–8.

10. Короткова О.В., Заботина Т.Н., Скотаренко Л.В. и др. Субпопуляции лимфоцитов периферической крови больных РМЖ. Российский биотерапевтический журнал 2011;10(3):95.

11. Скотаренко Л.В., Воротников И.К., Кадагидзе З.Г., Шамилов Ф.А. Особенности Т-клеточного иммунитета при раке молочной железы. Опухоли женской репродуктивной системы 2011;4:24–7.

12. Дубинкин И.В., Подгорная Т.В., Донсков С.И. Моноклональные реагенты анти-А и анти-В с новыми свойствами. Трансфузиология 2009;10(1–2):28.

13. Дубинкин И.В., Горшкова Т.В., Каландаров Р.С., Донсков С.И. Получение и испытание моноклональных анти DVI-антител. Трансфузиология 2009;10(1–2):27–28.

14. Филатов А.В., Бачурин П.С., Маркова Н.А., Сурнакова Н.Е. Панель моноклональных антител к антигенам человеческих лимфоцитов. Экспериментальная онкология 1989;11(2):29.

15. Барышников А.Ю., Фролова Е.А., Ленева Н.В. и др. Моноклональные антитела ICO-105 к рецептору интерлейкина-2(антиген CD25). Вестник РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН 1993;4(4):7–12.

16. Королева А.М., Барышников А.Ю., Виха Г.В. и др. Характеристика моноклональных антител ICO-116 к антигену CD16 естественных киллеров. Биотехнология 1993;(11–12):61.

17. Барышников А.Ю., Блохина Н.Г., Кадагидзе З.Г. Моноклональные антитела ИКО-1 против константной части IA-подобных антигенов. Экспериментальная онкология 1984;6:123.

18. Захарова Е.Н., Заботина Т.Н., Чудинов А.В. и др. Двухцветный анализ клеточных популяций метом проточной цитометрии с использованием цианинового красителя IMD-306. Мат-лы Всероссийской научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты»: тез. докл. М., 2007. С. 66.

19. Захарова Е.Н., Иванов П.К., Заботина Т.Н. и др. Иммунофлуоресцентные зонды на основе моноклональных антител ICO-31 и цианинового красителя IMD-506 для анализа клеточных популяций методом проточной цитометрии. Российский биотерапевтический жунал 2013;12(4):27–32.

20. Захарова Е.Н., Иванов П.К., Заботина Т.Н. и др. Двухцветный анализ клеточных популяций метом проточной цитометрии с использованием МКА серии ICO, конъюгированных с цианиновым красителем IMD-306. Российский биотерапевтический журнал 2014;13(1):17–21.

21. Копырулина М.Е., Захарова Е.Н., Заботина Т.Н. и др. Технология создания и свойства иммунофлуоресценных зондов с меткой Alexa-488 для анализа клеточных популяций методом проточной цитометрии. Российский биотерапевтический журнал 2018;17(1):70–5. DOI: 10.17650/1726978420181717075.

22. Stewart C.C., Stewart S.J. Four colour compensation. Cytometry 1999;38(4):161–75. PMID: 10440854.