СОЗДАНИЕ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫХ ЗОНДОВ МЕТОДОМ МОДИФИКАЦИИ ОЛИГОСАХАРИДОВ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ ФЛУОРЕСЦЕИН-5-ТИОСЕМИКАРБАЗИДОМ

Введение Моноклональные антитела (МКАТ) – надежный инструмент диагностики различных заболеваний человека. В этом качестве их используют в виде конъюгатов с флуоресцентными и иными метками. Классический подход создания таких конъюгатов сводится к химическим реакциям, использующим белковую основу МКАТ. Вместе с тем для целого ряда МКАТ синтез конъюгата сопровождается встраиванием метки в антигенсвязывающий участок, что приводит к уменьшению или полной потере специфической активности конъюгата. Для выхода из данной ситуации предлагается синтез флуоресцентных конъюгатов методами углеводной химии через пространственно удаленные от активного центра олигосахариды антител.
Цель исследования – получение активных и стабильных при хранении конъюгатов антител серии ICO на основе реакции ковалентного включения флуоресцентной метки в олигосахаридную последовательность МКАТ.
Материалы и методы В исследовании были использованы МКАТ серии ICO высокой степени очистки. Олигосахариды МКАТ окисляли до альдегидных групп, подвергали взаимодействию с флуоресцеин-5-тиосемикарбазидом с последующим восстановлением гидразонового производного боргидридами. Полученный ковалентный конъюгат исследовали в прямой реакции иммунофлуоресценции.
Результаты Отработаны тонкие детали синтеза флуоресцентного конъюгата МКАТ с использованием олигосахаридов последнего. Модифицированные МКАТ сохраняли специфическое связывание с клетками-мишенями, присущее нативным антителам. Полученные конъюгаты сохраняли свою активность на протяжении длительного времени в процессе хранения.
Заключение Разработан альтернативный метод для конъюгирования флуоресцентных меток с МКАТ, позволяющий получать конъюгаты высокой активности.

1. Grossberg L., Pressman D. Modification of arginine in the active sites of antibodies. Biochemistry 1968;7(1):272–9. DOI: 10.1021/bi00841a033.

2. Tawfik D.S., Chap R., Eshhar Z., Green BS. pH on–off switching of antibody-hapten binding by site-specific chemical modification of tyrosine. Protein Eng 1994;7(3):431–4. DOI: 10.1093/protein/7.3.431.

3. Dwek R.A., Lellouch A.C., Wormald M.R. Glycobiology: “the function of sugar in the IgG molecule”. J Anat 1995;187(Pt 2):279–92.

4. Matsumiya S., Yamaguchi Y., Saito J. et al. Structural comparison of fucosylated and nonfucosylated Fc fragments of human immunoglobulin G1. J Mol Biol 2007;4;368(3):767–79. DOI: 10.1016/j.jmb.2007.02.034.

5. Lund J., Takahashi N., Popplewell A. et al. Expression and characterization of truncated forms of humanized L243 IgG1. Architectural features can influence synthesis of its oligosaccharide chains and affect superoxide production triggered through human Fcgamma receptor I. Eur J Biochem 2000;267(24):7246–57. DOI: 10.1046/j.1432-1327.2000.01839.x.

6. Гриневич А.С., Краева М.Н., Бурова О.С. и др. Использование олигосахаридов иммуноглобулинов для модификации моноклональных антител. Российский биотерапевтический журнал 2016;15(4):44–8. DOI: 10.17650/1726-9784-2016-15-4- 44-48. [Grinevich A.S., Kraeva M.N., Burova O.S. et al. The use of oligosaccharides of immunoglobulin for modification of monoclonal antibodies. Rossiyskiy bioterapevticheskiy zhurnal = Russian Journal of Biotherapy 2016;15(4):44–8. (In Russ.)].

7. Ey P.L., Prowse S.J., Jenkin C.R. Isolation of pure IgG1, IgG2a, and IgG2b immunoglobulins from mouse serum using protein A-sepharose. Immunochemistry 1978;15(7):429–36. DOI: 10.1016/0161-5890(78)90070-6.

8. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 1970;15;227(5259):680–5. DOI: 10.1038/227680a0.

9. Hermanson G.T. Fluorescent Probes. In: Bioconjugate Techniques. 3th Ed. Academic Press, 2013:395–463. DOI: 10.1016/B978-0-12-382239-0.00010-8.

10. Голубцова Н.В., Бурова О.С., Барышников К.А. и др. Моноклональные антитела ICO-406 против антигена CD117. Российский биотерапевтический журнал 2015;14(2):99–104. [Golubtsova N.V., Burova O.S., Baryshnikov K.A. at al. Monoclonal antibodies ICO-406 against the antigen CD117. Rossiyskiy bioterapevticheskiy zhurnal = Russian Journal of Biotherapy 2015;14(2):99–104. (In Russ.)].

11. Wolfe C.A., Hage D.S. Studies on the rate and control of antibody oxidation by periodate. Anal Biochem 1995;231(1):123–30. DOI: 10.1006/abio.1995.1511.

12. Al-Mawali A., Pinto A.D., Busaidi. R.A., Al-Zakwani I. Lymphocyte subsets: reference ranges in an age- and gender-balanced population of Omani healthy adults. Cytometry 2013;83(8):739–44. DOI: 10.1002/cyto.a.22322.

13. Vira S., Mekhedov E., Humphrey G. et al. Fluorescent-labeled antibodies: Balancing functionality and degree of labeling. Anal Biochem 2010;402(2):146–50. DOI: 10.1016/j.ab.2010.03.036.