СХОДИМОСТЬ И ВРЕМЕННÁЯ СТАБИЛЬНОСТЬ КОЛИЧЕСТВЕННОЙ ОЦЕНКИ ЭКСПРЕССИИ БЕЛКА βIII-ТУБУЛИНА В ТКАНИ СÓЛИДНЫХ ОПУХО

Введение. Введение в клиническую практику молекулярного фенотипирования опухолей продемонстрировало необходимость создания новых аналитических методов оценки экспрессии маркёров в сóлидных новообразованиях, поскольку рутинно используемый метод иммуногистохимии характеризуется рядом существенных недостатков.

Цель исследования – аналитическая валидация разработанного авторами иммунофлуоресцентного метода, ассоциированного с проточной цитометрией, для изучения опухолевых белковых маркёров в ткани сóлидных новообразований.

Материалы и методы. Валидация метода проведена при количественной оценке экспрессии белка βIII-тубулина (TUBB3) в суспензиях клеток немелкоклеточного рака легкого, полученных из хирургических образцов опухоли. Для иммунофлуоресцентного окрашивания использованы первичные антитела к TUBB3 (ab7751) и вторичные – конъюгированные с красителем DyLight 650 (ab98729). Для измерения флуоресценции клеток использовали проточный цитометр Navios (Beckman Coulter). Для оценки валидационных параметров использован коэффициент вариации, рассчитанный как отношение среднеквадратического отклонения уровня TUBB3 к его среднему значению.

Результаты. Проведен анализ 2 параметров: сходимости и временнóй стабильности результатов оценки экспрессии TUBB3. Показано, что средний коэффициент вариации уровня экспрессии исследованного маркёра в ткани опухоли при оценке сходимости и стабильности иммунофлуоресцентной окраски не превысил 20 %. Согласно рекомендациям по аналитической валидации методов, основанных на использовании проточного цитометра, это доказывает валидность метода по исследованным параметрам.

Заключение. Показана сходимость и временнáя стабильность результатов количественной оценки экспрессии прогностически и предиктивно значимого белка TUBB3 в ткани сóлидных опухолей при использовании разработанного авторами метода иммунофлуоресцентного окрашивания, ассоциированного с проточной цитометрией. Отмечена практическая значимость факта временнóй стабильности иммунофлуоресцентной окраски при хранении суспензии окрашенных клеток в темноте при 4 °C в течение 24 ч, что указывает на возможность варьирования интервала времени от завершения аналитической части исследования до работы на проточном цитометре.

1. Gown A.M. Current issues in ER and HER2 testing by IHC in breast cancer. Mod Pathol 2008;(21Suppl 2):8–15. DOI: 10.1038/modpathol.2008.34.

2. Bogush T.A., Kaliuzhny S.A., Basharina A.A. et al. Immunofluorescence Analysis of the Vimentin Expression in Epithelial Cells. Moscow Univ Chem Bull 2019;74(6):290–5. DOI: 10.3103/S0027131419060063.

3. Friboulet L., Olaussen K.A., Pignon J.P. et al. ERCC1 isoform expression and DNA repair in non-small-cell lung cancer. N Engl J Med 2013;368(12):1101–10. DOI: 10.1056/nejmoa1214271.

4. Bogush T.A., Shaturova A.S., Dudko E.A. et al. Quantitative immunofluorescent estimation of estrogen receptor β expression in human solid tumors using flow cytometry. Moscow Univ Chem Bull 2011;66:305–12. DOI: 10.3103/S0027131411040031.

5. Мамичев И.А., Богуш Т.А., Богуш Е.А. и др. Белок микротрубочек βIII-тубулин: строение, экспрессия и функции в нормальных и опухолевых клетках. Антибиотики и химиотерапия 2018;63(7–8):79–90.

6. Selliah N., Eck S., Green C. et al. Flow cytometry method validation protocols. Curr Protoc Cytom 2019;87(1):53. DOI: 10.1002/cpcy.53.

7. Brown L., Green C., Jones N. et al. Recommendations for the evaluation of specimen stability for flow cytometric testing during drug development. J Immunol Methods 2015;418:1–8. DOI: 10.1016/j.jim.2015.01.008.

8. Wood B., Jevremovic D., Bene M.C. et al. Validation of cell-based fluorescence assays: practice guidelines from the ICSH and ICCS – part V – assay performance criteria. Cytometry B Clin Cytom 2013;84(5):315–23. DOI: 10.1002/cyto.b.21108.