Нанозонды на основе флуоресцентных полупроводниковых нанокристаллов и однодоменных антител для высокочувствительной детекции рецептора эпидермального фактора роста в опухолевых клетках

Введение. Разработка инновационных средств флуоресцентной визуализации, представляющих собой нанозонды – конъюгаты квантовых точек (КТ) и однодоменных антител (одАТ), специфически распознающих биомаркеры опухолей, в частности рецептор эпидермального фактора роста (EGFR), является актуальным направлением усовершенствования подходов к иммуногистохимическому типированию опухолей.

Цель исследования – разработка флуоресцентных нанозондов на основе КТ и одАТ, специфически распознающих EGFR, а также оценка их функциональных характеристик (размера и оптических свойств) и функциональной активности.

Материалы и методы. КТ получены методом металлоорганического высокотемпературного синтеза и переведены в водную фазу посредством поэтапной замены лигандов на поверхности КТ. Ориентированную конъюгацию КТ и одАТ осуществляли с использованием бифункционального агента для кросс-сшивки. Полученные конъюгаты комплексно охарактеризованы методами динамического светорассеяния и иммуноанализа. Функциональную активность оценивали на модельной линии опухолевых клеток эпидермоидной карциномы А431.

Результаты. Разработанные конъюгаты стандартизованы по контрольным параметрам, обусловливающим их функциональную активность, в частности по гидродинамическому диаметру и эффективности связывания с опухолевыми клетками-мишенями, и характеризуются высокой дисперсностью, гомогенностью, специфической функциональной активностью по отношению к исследованной молекулярной мишени.

Заключение. Полученные результаты демонстрируют потенциальную возможность использования разработанных конъюгатов КТ и одАТ для детекции EGRF при иммуногистохимическом типировании опухолей.

1. Dagogo-Jack I., Shaw A. Tumour heterogeneity and resistance to cancer therapies. Nat Rev Clin Oncol 2018;15(2):81–94. DOI: 10.1038/nrclinonc.2017.166

2. Gupta G.K., Collier A.L., Lee D. et al. Perspectives on triplenegative breast cancer: current treatment strategies, unmet needs, and potential targets for future therapies. Cancers 2020;12(9):2392. DOI: 10.3390/cancers12092392

3. Sheikine Y., Rangachari D., McDonald D.C. et al. EGFR testing in advanced non-small-cell lung cancer, a mini-review. Clin Lung Cancer 2016;17(6):483–92. DOI: 10.1016/j.cllc.2016.05.016

4. Inamura K. Update on immunohistochemistry for the diagnosis of lung cancer. Cancers 2018;10(3):72. DOI: 10.3390/cancers10030072

5. Mehner C., Oberg A.L., Goergen K.M. et al. EGFR as a prognostic biomarker and therapeutic target in ovarian cancer: evaluation of patient cohort and literature review. Genes Cancer 2017;8(5–6):589–99. DOI: 10.18632/genesandcancer.142

6. Fenizia F., De Luca A., Pasquale R. et al. EGFR mutations in lung cancer: from tissue testing to liquid biopsy. Future Oncol 2015;11(11):1611–23. DOI: 10.2217/fon.15.23

7. Zhang W., Hubbard A., Jones T. et al. Fully automated 5-plex fluorescent immunohistochemistry with tyramide signal amplification and same species antibodies. Lab Invest 2017;97(7):873–85. DOI: 10.1038/labinvest.2017.37

8. Wan H., Yue J., Zhu S. et al. A bright organic NIR-II nanofluorophore for three-dimensional imaging into biological tissues. Nat Commun 2018;9(1):1171. DOI: 10.1038/s41467-018-03505-4

9. Montecinos-Franjola F., Lin J.Y., Rodriguez E.A. Fluorescent proteins for in vivo imaging, where’s the biliverdin? Biochem Soc Trans 2020;48(6):2657–67. DOI: 10.1042/BST20200444

10. Deshayes S., Divita G. Fluorescence technologies for monitoring interactions between biological molecules in vitro. Prog Mol Biol Transl Sci 2013;113:109–43. DOI: 10.1016/B978-0-12-386932-6.00004-1

11. Bilan R., Nabiev I., Sukhanova A. Quantum dot-based nanotools for bioimaging, diagnostics, and drug delivery. Chembiochem 2016;17(22):2103–114. DOI: 10.1002/cbic.201600357

12. Nifontova G., Krivenkov V., Zvaigzne M. et al. Controlling charge transfer from quantum dots to polyelectrolyte layers extends prospective applications of magneto-optical microcapsules. ACS Appl Mater Interfaces 2020;12(32):35882–94. DOI: 10.1021/acsami.0c08715

13. Dumoulin M., Conrath K., Van Meirhaeghe A. et al. Singledomain antibody fragments with high conformational stability. Protein Sci 2002;11(3):500–15. DOI: 10.1110/ps.34602

14. Staus D.P., Wingler L.M., Strachan R.T. et al. Regulation of β2-adrenergic receptor function by conformationally selective single-domain intrabodies. Mol Pharmacol 2014;85(3):472–81. DOI: 10.1124/mol.113.089516

15. Liu J.L., Goldman E.R., Zabetakis D. et al. Enhanced production of a single domain antibody with an engineered stabilizing extra disulfide bond. Microbial Cell Factories 2015;14(1):158. DOI: 10.1186/s12934-015-0340-3

16. Ramos-Gomes F., Bode J., Sukhanova A. et al. Single- and twophoton imaging of human micrometastases and disseminated tumour cells with conjugates of nanobodies and quantum dots. Sci Rep 2018;8(1):4595. DOI: 10.1038/s41598-018-22973-8

17. Brazhnik K., Nabiev I., Sukhanova A. Oriented conjugation of single-domain antibodies and quantum dots. In: Quantum Dots: Applications in Biology. Methods in Molecular Biology. N.-Y.: 2014. P. 129–140.

18. Sukhanova A., Ramos-Gomes F., Chames P. et al. Multiphoton deep-tissue imaging of micrometastases and disseminated cancer cells using conjugates of quantum dots and single-domain antibodies. In: Multiplexed Imaging. Methods in Molecular Biology. N.-Y.: 2021. P. 105–123.

19. Dang X., Bardhan N.M., Qi J. et al. Deep-tissue optical imaging of near cellular-sized features. SciRep 2019;9(1):3873. DOI: 10.1038/s41598-019-39502-w