Технология создания и свойства иммунофлуоресцентных зондов с меткой alexa-488 для анализа клеточных популяций методом проточной цитометрии

Получение флуоресцентных зондов на основе моноклональных антител (МКА) к поверхностным антигенам лейкоцитов человека является актуальной задачей, решение которой даст возможность проводить научные и клинические исследования в области онкологии, гематологии, иммунологии, эпидемиологии. Цель исследования – создание флуоресцентных зондов на основе МКА и флуоресцентного красителя Alexa-488 для анализа клеточных популяций и субпопуляций лейкоцитов человека методом проточной цитометрии. Материалы и методы. В работе использовали МКА к антигену В-лимфоцитов (клон ИКО-180) и флуоресцентный краситель Alexa-488 в форме активного моносукцинимидного эфира. МКА выделяли из асцитной жидкости мышей с привитой внутрибрюшинно гибридомой путем комбинированной очистки иммуноглобулиновой фракции каприловой кислотой и высаливания сульфатом аммония. Для очистки полученных конъюгатов (иммунофлуоресцентных зондов, ИФЗ) применяли гель-фильтрацию на колонке PD-10, концентрацию и плотность мечения ИФЗ определяли спектрофотометрически. Оценку биологической активности полученных ИФЗ проводили с использованием клеток периферической крови доноров в диапазоне концентраций МКА 0,5–100 мкг/мл. Определение рабочего титра ИФЗ проводили по методу титрования антител, предложенному C.C. Stewart. Результаты. Экспериментально установлено оптимальное время инкубирования МКА с флуорофором. Получена панель ИФЗ с различной плотностью мечения Alexa-488. Для этого варьировали молярное соотношение МКА и флуорофора в среде реакции конъюгирования от 1:2 до 1:100. Оптимальная плотность мечения ИФЗ находится в диапазоне 5–13,5 М:М, концентрация антител – в диапазоне 5–25 мкг/мл. Для ИФЗ из МКА ИКО-180 с Alexa-488 такие высокие значения плотности мечения не приводят к снижению эффективности флуоресценции и антигенсвязывающей способности. Сравнительная характеристика специфической активности ИФЗ на основе МКА ИКО-180 и коммерческих ИФЗ (BD Biosciences) показала сопоставимые результаты. Заключение. Оптимальными условиями для мечения МКА ИКО-180 красителем являются: карбонатный буфер с рН 8,3, концентрация антител в реакционной смеси 1 мг/мл, количество активного красителя 10–100 ммоль на 1 ммоль белка,время инкубирования 90 мин при температуре 18–25 °С.

1. Levy E.M., Roberti M.P., Mordoh J. et al. Natural killer cells in human cancer: from biological functions to clinical applications. J Biomed Biotechnol 2011:1–11. DOI: 10.1155/2011/676198.

2. Кадагидзе З.Г., Черткова А.И., Заботина Т.Н. и др. Основные субпопуляции регуляторных лимфоцитов у больных злокачественно меланомой и раком молочной железы. Иммунология 2014;35(2):64–7.

3. Berlier J.E., Rothe A., Buller G. et al. Quantitative Comparison of Long-wavelength Alexa Fluor Dyes to Cy Dyes: Fluorescence of the Dyes and Their Bioconjugates. J Histochem Cytochem 2003;51:1699–712. DOI: 10.1177/002215540305101214. PMID: 14623938.

4. Panchuk-Voloshina N., Haugland R.P., Bishop-Stewart J. et al. Alexa Dyes, a Series of New Fluorescent Dyes that Yield Exceptionally Bright, Photostable Conjugates. J Histochem Cytochem 1999;47:1179–88. DOI: 10.1177/002215549904700910. PMID: 10449539.

5. Барышников А.Ю., Фролова Е.А., Ленева Н.В. и др. Моноклональные антитела ICO-105 к рецептору интерлейкина-2 (антиген CD25). Вестник РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН 1993;4(4):7–12.

6. Королева А.М., Барышников А.Ю., Виха Г.В. и др. Характеристика моноклональных антител ICO-116 к антигену CD16 естественных киллеров. Биотехнология 1993;61:11–2.

7. Барышников А.Ю., Блохина Н.Г., Кадагидзе З.Г. Моноклональные антитела ИКО-1 против константной части IA-подобных антигенов. Экспериментальная онкология 1984;6:123.

8. Haugland R.P. Antibody conjugates for cell biology. In: Current protocols in cell biology. Wiley & Sons, 2001. Unit 16.5.

9. Haugland R.P. Handbook of Fluorescent Probes and Research Products. 9th ed. Eugene, OR. Molecular Probes 2002. Section 1.3.

10. Stewart C.C., Stewart S.J. Four colour compensation. Cytometry 1999;38(4):161–75. PMID: 10440854.