Масштабирование технологии получения липосомальной формы тетра-3-фенилтиофталоцианина гидроксиалюминия и изучение ее мутагенных и иммунотоксических свойств

Применение липосом в качестве систем доставки лекарственных средств в организм человека сегодня является признанным подходом к повышению эффективности лечения. По сравнению с другими наноразмерными носителями липосомы отличаются высокой биосовместимостью. Однако в литературных источниках имеется ряд данных об иммуногенности некоторых липосомальных препаратов. Проявления реакции гиперчувствительности средней и тяжелой степени отмечены у части пациентов при внутривенном введении липосом Doxil®, Ambisome®, DaunoХome®. Технология производства липосом – достаточно трудоемкий процесс, поэтому получение липосомальных лекарственных форм (ЛЛФ) в промышленных масштабах для проведения доклинических и клинических исследований проблематично для исследователей и производителей всего мира. В связи с этим актуальным представляется проведение исследований специфической токсичности липосомальных препаратов и масштабирования технологии получения липосом. Цель исследования – оценка качества опытных образцов ЛЛФ на основе тетра-3-фенилтиофталоцианина гидроксиалюминия, полученных по масштабированной технологии, в сравнении с образцами, произведенными в лабораторных условиях, а также изучение их мутагенных и иммунотоксических свойств. Объект исследования – тетра-3-фенилтиофталоцианин гидроксиалюминия липосомальный, лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 1,5 мг, во флаконах вместимостью 20 мл. Материалы и методы. В работе использовались метод Бенгема, экструзия, стерилизующая фильтрация, лиофилизация; тест на нарушение целостности межклеточных контактов (на промоторную активность), бактериальный тест Эймса, цитогенетическое исследование по учету хромосомных аберраций, тест на способность вызывать повреждение ДНК (тест ДНК-комет), метод Ерне; реакция гиперчувствительности замедленного типа, определение массы и клеточности центральных и периферических органов иммунитета, оценка фагоцитарной активности перитонеальных макрофагов. Результаты. По результатам проведенных исследований масштабирована технология получения ЛЛФ, позволяющая получать до 400 флаконов ЛЛФ за один производственный цикл. Установлено, что ЛЛФ в дозах 6 и 24 мг/кг не увеличивает количество хромосомных аномалий у мышей и не вызывает повреждений ДНК, в дозах 1,1–22,0 мкг/чашка не проявляет мутагенной активности в бактериальном тесте Эймса, в диапазоне концентраций 0,062–3,1 мкг в тесте на промоторную активность не разобщает межклеточные контакты. Определено, что ЛЛФ в дозах 6 и 12 мг/кг при 1-кратном внутривенном введении не оказывает влияния на гуморальный и клеточный иммунные ответы, не изменяет массу и клеточность центральных и периферических органов иммунной системы. ЛЛФ через 24 ч после введения в дозах 6 и 12 мг/кг дозозависимо снижает фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов, которая восстанавливается через 7 сут. Заключение. Масштабирована технология получения ЛЛФ. В исследуемых дозах установлено отсутствие у ЛЛФ способности промотировать процесс канцерогенеза и влиять на гуморальный и клеточный иммунные ответы.

1. Maeda H.,WuJ.,Sawa T.et al.Tumor vascular permeability and the EPR effect in macromolecular therapeutics: a review. J Control Rel 2000; 65:271–84. doi:10.1016/S0168-3659(99)00248-5.

2. Wick P.,Manser P.,Limbach L.K.et al. The degree and kind of agglomeration affect carbon nanotube cytotoxicity. Toxicol Lett 2007; 168(2):121–31. doi:10.1016/j.toxlet.2006.08.019.

3. Ziemba B.,Matuszko G., Bryszewska M.,Klajnert B. Influence of dendrimers on red blood cells. Cell Moll Biol Lett 2012; 17(1):21–35. doi:10.2478/s11658-011-0033-9.

4. Аляутдин Р.Н.,Романов Б.К. Рекомендации по оценке безопасности лекарственных средств,содержащих наночастицы. Безопасность и риск фармакотерапии 2015; 4:10–22.

5. Szebeni J.,Muggia F.,Gabizon A., Barenholz Y.Activation of complement by therapeutic liposomes and other lipid excipient-based therapeutic products: prediction and prevention. Adv Drug Deliv Rev 2011;63(12):1020–30. doi:10.1016/j.addr.2011.06.017.

6. Brissette J.L.,Kumar N.M.,Gilula N.B., Dotto G.P. The tumor promoter 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate and the ras oncogene modulate expression and phosphorylation of gap junction proteins. Mol Cell Biol 1991; 11:5364–71.

7. Abbaci M.,Barberi-Heyob M.,Blondel W. et al. Advantages and limitations of commonly used methods to assay the molecular permeability of gap junctional intercellular communication .BioTechniques 2008; 45:33–46. doi:10.1128/MCB.11.10.5364.

8. Na M.R.,Koo S.K.,Kimd.Y. et al.In vitro inhibition of gap junctional intercellular communication by chemical carcinogens. Toxicology 1995; 98:199–206. doi:10.1016/0300-483X(94)02931-J.

9. Maron D.M.,Ames B.N. Revised methods for the Salmonella mutagenicity test. Mutat Res 1983;113(3–4):173–215. doi:10.1016/0165-1161(83)90010-9.

10. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Методические указания по оценке мутагенных свойств фармакологических препаратов. М.: ГрифиК, 2012. Ч.1. 944с.

11. Белицкий Г.А.,Ревазова Ю.А., Абилев С.К. и др. Методические рекомендации по исследованию канцерогенных свойств фармакологических и лекарственных средств. Ведомости Фармакологического комитета 1998; 1:21–4.

12. Фонштейн Л.М.,Абелев С.К., Бобринев Е.В. и др. Методы первичного выявления генетической активности загрязнителей среды спомощью бактeриальных тест-систем (Методические указания). М.,1983.34с.

13. Ford C.E.,Hamerton J .L. Chromosomes of five rodent species. Nature 1956; 31:247–54.

14. Оценка генотоксических свойств методом ДНК-комет in vitro. Методические рекомендации. М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора,2010.

15. Olive P.L.,Banath J.P. The comet assay: a method to measure DNA damage in individual cells. Nat Protoc 2006; 1(1):23–9. doi:10.1038/nprot.2006.5.

16. Budunova I.V., Mittelman L.A., Belitsky G.A. Identification of tumor promoters by their inhibitory effect on intercellular transfer of lucifer yellow. Cell Biol Toxico l1989;5(1):77–89. doi:10.1007/BF00141066.

17. Ostling O.,Johanson K.J. Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damage in individual mammalian cells. Biochem Biophys Res Commun 1984;123:291–8. doi:10.1016/0006-291X(84)90411-X.

18. Иванова А.С.,Мастернак Т.Б., Мартынов А.И. Принципы изучения иммунотоксического действия фарма кологических препаратов. Токсикологический вестник 2010;5:26–31.

19. Иванова А.С.,Мастернак Т.Б.,Малкина Е.Ю., Мартынов А.И. Принципы оценки иммунологической безопасности фармацевтических продуктов. Биомедицина 2011;(3):94–7.

20. Jerne N.K., Nordin A.A. Plaque formation in agar by single antibody-producing cells. Science 1963;140:405.

21. Подоплелов И.И.,Крылов О.Р., Медуницын Н.В. Эванс синий как адъювант для получения повышенной чувствительности замедленного типа в эксперименте. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины 1985;6:729.

22. Raz A.,Bucana C.,Fogler W.E.et al. Biochemical,Morphological,and Ultrastructural Studies on the Uptake of Liposomes by Murine Macrophages. Cancer Res 1981;41:487–94.PMID:7448797.