Исследование воздействия аранозы, цисплатина и паклитаксела в монорежиме и в сочетании на активность Pd–l1 и Pd–l2 в клетках меланомы

Введение. В настоящее время для лечения рака применяются следующие подходы: хирургическое удаление опухоли, химиотерапия, таргетная терапия и иммунотерапия. Комбинирование препаратов различных классов позволяет добиться большего терапевтического эффекта по сравнению с их применением в монорежиме. Более того, могут наблюдаться и другие эффекты, в том числе изменение уровня экспрессии белков PD–L1 и PD–L2, важных мишеней чекпойнт-терапии.

Цель исследования – оценить влияние аранозы, цисплатина и паклитаксела в монорежиме или в комбинации на изменение уровня экспрессии мРНК и белков PD–L1 и PD–L2 в клеточных линиях меланомы и сопоставить результат со степенью дифференцировки клеток и наличием или отсутствием мутаций.

Материалы и методы. Исследования проводили на клеточных линиях меланомы человека, полученных из опухолевого материала больных. Уровень экспрессии генов PD–L1 и PD–L2 оценивали методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени. В реакции иммунофлуоресценции оценивали экспрессию белков PD–L1 и PD–L2. Данные анализировали методами корреляционного анализа и медианного теста.

Результаты. Уровень экспрессии гена PD–L2 прямо коррелировал со степенью дифференцировки клеток (коэффициент Пирсона 0,937, p <0,15). Активность гена PD–L1 и белков PD–L1 и PD–L2 не связана со степенью дифференцировки, а также не зависит от наличия мутаций гена TP53. PD–L2 экспрессируется на меньшем уровне в клеточных линиях, имеющих мутации гена BRAF (p = 0,0117). Интересно, что мутации в гене TP53 наблюдаются при наличии мутаций BRAF (коэффициент Пирсона 1, p <0,15). Воздействие аранозы привело к увеличению уровня экспрессии гена PD–L1 (p = 0,23). Инкубация с цисплатином в комбинации с паклитакселом также приводила к увеличению уровня экспрессии белка PD–L1 (p = 0,037). Цисплатин и паклитаксел в монорежиме не оказывали влияния на экспрессию белка PD–L1. Уровень экспрессии гена и белка PD–L2 снижался под действием любого препарата, но статистически незначимо (р = 0,6).

Выводы. Исследованные препараты практически не оказывают влияния на уровень экспрессии PD–L1 и PD–L2 как на уровне белка, так и на уровне мРНК. Из этого следует, что сочетание анти-PD терапии и противоопухолевых препаратов, таких как паклитаксел и араноза, потенциально не снизит эффективность чекпойнт-терапии и может иметь большие перспективы применения в будущем при создании протоколов комбинированной терапии.

меланома, PD–L1, PD–L2, араноза, цисплатин, паклитаксел

1. Berger M.F., Hodis E., Heffernan T.P. et al. Melanoma genome sequencing reveals frequent PREX2 mutations. Nature 2012;485(7399):502–6. PMID: 22622578. DOI: 10.1038/nature11071.

2. Pleasance E.D., Cheetham R.K., Stephens P.J. et al. A comprehensive catalogue of somatic mutations from a human cancer genome. Nature 2010;463(7278):191–6. PMID: 20016485. DOI: 10.1038/nature08658.

3. van den Hurk K., Niessen H.E., Veeck J. et al. Genetics and epigenetics of cutaneous malignant melanoma: a concert out of tune. Biochim Biophys Acta 2012;1826(1):89–102. PMID: 22503822. DOI: 10.1016/j.bbcan.2012.03.011.

4. Sosman J.A., Kim K.B., Schuschter L. et al. Survival in BRAF V600-mutant advanced melanoma treated with vemurafenib. N Engl J Med 2012;366(8):707–14. PMID: 22356324. DOI: 10.1056/NEJMoa1112302.

5. Jakob J.A., Bassett R.L. Jr., Ng C.S. et al. NRAS mutation status is an independent prognostic factor in metastatic melanoma. Cancer 2012;118(16):4014–23. PMID: 22180178. DOI: 10.1002/cncr. 26724.

6. Long G.V., Menzies A.M., Nagrial A.M. et al. Prognostic and clinicopathologic associations of oncogenic BRAF in metastatic melanoma. J Clin Oncol 2011;29(10):1239–46. PMID: 21343559. DOI: 10.1200/JCO.2010.32.4327.

7. Klein R.M., Aplin A.E. Rnd3 regulation of the actin cytoskeleton promotes melanoma migration and invasive outgrowth in three dimensions. Cancer Res 2009;69(6):2224–33. PMID: 19244113. DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-08-3201.

8. Arozarena I., Sanchez-Laorden B., Packer L. et al. Oncogenic BRAF induces melanoma cell invasion by downregulating the cGMP-specific phosphodiesterase PDE5A. Cancer Cell 2011;19(1):45–57. PMID: 21215707. DOI: 10.1016/j.ccr.2010.10.029.

9. Zelboraf® (Vemurafenib) US prescribing information 2014. Genentech USA, Inc. South San Francisco, CA [Электронный ресурс]. URL: http://www.gene.com/download/pdf/zelboraf_prescribing.pdf.

10. Tafinlar® (Dabrafenib) US prescribing information 2014. GlaxoSmithKline. Research Triangle Park, NC [Электронный ресурс]. URL: http://us.gsk.com/products/assets/us_tafinlar. pdf.

11. Mekinist® (Trametinib) US prescribing information 2014. GlaxoSmithKline. Research Triangle Park, NC [Электронный ресурс]. URL: http://us.gsk.com/products/assets/us_mekinist. pdf.

12. Davies H., Bignell G.R., Cox C. et al. Mutations of the BRAF gene in human cancer. Nature 2002;417(6892):949–54. PMID: 12068308. DOI:10.1038/nature00766.

13. Ключагина Ю.И., Соколова З.А., Барышникова М.А. Роль рецептора PD1 и его лигандов PDL1 и PDL2 в иммунотерапии опухолей. Онкопедиатрия 2017;4(1):49–55. DOI: 10.15690/onco.v4i1.1684. [Klyuchagina Y.I., Sokolova Z.A., Baryshnikova M.A. Role of PD-1 Receptor and Its Ligands PD–L1 and PD–L2 in Cancer Immunotherapy. Onkopediatriya = Oncopediatrics 2017;4(1):49–55. (In Russ.)].

14. Чкадуа Г.З. Подходы к иммунотерапии опухолей. Российский биотерапевтический журнал 2016;15(1):118. [Chkadua G.Z. Approaches to Cancer Immunotherapy. Rossiysky Bioterapevtichesky Zhurnal = Russian Journal of Biotherapy 2016;15(1):118 (In Russ.)].

15. Барышникова М.А., Кособокова Е.Н., Косоруков В.С. Неоантигены в иммунотерапии опухолей. Российский биотерапевтический журнал 2018;17(2):6–14. DOI: 10.17650/1726-9784-2018-17-2-6-14. [Baryshnikova M.A., Kosobokova E.N., Kosorukov V.S. Neoantigens in tumor immunotherapy Rossiysky Bioterapevtichesky Zhurnal = Russian Journal of Biotherapy 2018;17(2):6–14. (In Russ.)].

16. Ishida Y., Agata Y., Shibahara K., Honjo T. Induced expression of PD-1, a novel member of the immunoglobulin gene superfamily, upon programmed cell death. EMBO J 1992;11:3887–95. PMID: 1396582. DOI:10.1002/j.1460-2075.1992. tb05481. .

17. Пономарев А.В., Мисюрин В.А., Рудакова А.А. и др. Изменение экспрессии PD–L1 и PD–L2 в клеточных линиях меланомы человека при воздействии различных лекарственных форм аранозы и «пустых» липосом. Российский биотерапевтический журнал 2017;16(2):74–81. DOI: 10.17650/1726-9784-2017-16-2-74-81. [Ponomarev A.V., Misyurin V.A., Rudakova A.A. et al. The influence of aranoza drug formulations and “empty” liposomes on the expression of PD–L1 и PD–L2 in human melanoma cell lines. Rossiysky Bioterapevtichesky Zhurnal = Russian Journal of Biotherapy 2017;16(2):74–81. (In Russ.)].

18. Pedoeem A., Azoulay-Alfaguter I., Strazza M. et al. Programmed death-1 pathway in cancer and autoimmunity. Clin Immunol 2014;153(1):145–52. PMID:24780173. DOI:10.1016/j.clim.2014.04.010.

19. Francisco L.M., Sage P.T., Sharpe A.H. The PD-1 pathway in tolerance and auto-immunity. Immunol Rev 2010;236:219–42. PMID: 20636820. DOI: 10.1111/j.1600-065X.2010.00923.x.

20. Ishida M., Iwai Y., Tanaka Y. et al. Differential expression of PD–L1 and PD–L2, ligands for an inhibitory receptor PD-1, in the cells of lymphohematopoietic tissues. Immunol Lett 2002;84(1):57–62. PMID: 2161284. DOI: 10.1016/s0165-2478(02)00142-6.

21. Shin D.S., Ribas A. The evolution of checkpoint blockade as a cancer therapy: what’s here, what’s next? Curr Opin Immunol 2015;33:23–35. PMID: 25621841. DOI: 10.1016/j.coi.2015.01.006.

22. Рудакова А.А., Пономарев А.В., Бурова О.С. и др. Изменение уровня экспрессии лигандов белка PD1 в клетках линий меланомы человека после воздействия субстанции и липосомальной лекарственной форм аранозы Российский биотерапевтический журнал 2017;16(1):68. [Rudakova A.A., Ponomarev A.V., Burova O.S. et al. Change of PD1 ligands expression level after Aranose substance and liposomal drug formulation in melanoma cell lines. Rossiysky Bioterapevtichesky Zhurnal = Russian Journal of Biotherapy 2017;16(1):68. (In Russ.)].

23. Рудакова А.А., Мисюрин В.А., Пономарев А.В. и др. Возможность моделирования активности маркеров PD–L1 и PD–L2 на поверхности клеток меланомы. Российский биотерапевтический журнал 2018;17(спецвыпуск): 64. [Rudakova A.A., Misyurin V.A., Ponomarev A.V. et al. Modulation of PD–L1 and PD–L2 activity on melanoma cells. Rossiysky Bioterapevtichesky Zhurnal = Russian Journal of Biotherapy 2018;17(Special Issue): 64. (In Russ.)].

24. Intlekofer A.M., Thompson C.B. At the bench: preclinical rationale for CTLA-4 and PD-1 blockade as cancer immunotherapy. J Leukoc Biol 2013;94(1):25–39. PMID:23625198. DOI: 10.1189/jlb.1212621.

25. Iwai Y., Terawaki S., Honjo T. PD-1 blockade inhibits hematogenous spread of poorly immunogenic tumor cells by enhanced recruitment of effector T cells. Int Immunol 2005;17(2):133–44. MID: 15611321. DOI: 10.1093/intimm/dxh194.

26. Жуликов Я.А., Фетисов Т.И., Самойленко И.В., Демидов Л.В. Механизмы резистентности метастатической меланомы кожи к анти-PD-1 терапии. Российский биотерапевтический журнал 2018;17(1):34–46. DOI: 10.17650/1726-9784-2018-17-1-34-46. [Zhulikov Ya.A., Fetisov T.I., Samoylenko I.V., Demidov L.V. Mechanisms of resistance to anti-PD-1 therapy in metastatic cutaneous melanoma Rossiysky Bioterapevtichesky Zhurnal = Russian Journal of Biotherapy 2018;17(1):34–46. (In Russ.)].

27. Topalian S.L., Sznol M., McDermott D. F. et al. Survival, durable tumor remission, and long-term safety in patients with advanced melanoma receiving nivolumab. J Clin Oncol 2014;32:1020–30. PMID: 24590637. DOI: 10.1200/JCO.2013.53.0105.

28. Wargo J.A., Reuben A., Cooper Z.A. et al. Immune effects of chemotherapy, radiation, and targeted therapy and opportunities for combination with immunotherapy. Semin Oncol 2015;42(4):601–16. PMID: 26320064. DOI: 10.1053/j.seminoncol.2015.05.007.

29. Postow M.A., Chasalow S.D., Yuan J. et al. Pharmacodynamic effect of ipilimumab on absolute lymphocyte count (ALC) and association with overall survival in patients with advanced melanoma. J Clin Oncol 2013;31(15):abstr 9052. 30. Donia M., Fagone P., Nicoletti F. et al. BRAF inhibition improves tumor recognition by the immune system: potential implications for combinatorial therapies against melanoma involving adoptive T-cell transfer. Oncoimmunology 2012;1:1476–83. PMID: 23264894. DOI: 10.4161/onci.21940.

30. Frederick D.T., Piris A., Cogdill A.P. et al. BRAF inhibition is associated with enhanced melanoma antigen expression and a more favorable tumor microenvironment in patients with metastatic melanoma. Clin Cancer Res 2013;19:1225–31. PMID: 23307859. DOI: 10.1158/1078-0432.CCR-12-1630.

31. Jiang X., Zhou J., Giobbie-Hurder A. et al. The activation of MAPK in melanoma cells resistant to BRAF inhibition promotes PD–L1 expression that is reversible by MEK and PI3K inhibition. Clin Cancer Res 2013;19:598–609. PMID: 23095323. DOI: 10.1158/1078-0432.CCR-12-2731.

32. Cooper Z.A., Juneja V.R., Sage P.T. et al. Response to BRAF inhibition in melanoma is enhanced when combined with immune checkpoint blockade. Cancer Immunol Res 2014;2:643–54. PMID: 24903021. DOI: 10.1158/2326-6066.CIR-13-0215.

33. Ribas A., Hodi F.S., Callahan M. et al. Hepatotoxicity with combination of vemurafenib andipilimumab. N Engl J Med 2013;368(14):1365–6. PMID: 23550685. DOI: 10.1056/NEJMc1302338.

34. Dasari S., Tchounwou P.B. Cisplatin in cancer therapy: molecular mechanisms of action. Europ J Pharm 2014;740:364–78. РMID: 25058905. DOI: 10.1016/j. ejphar. 2014.07.025P.

35. Gottesman M.M., Fojo T., Bates S.E. Multidrug resistance in cancer: role of ATP-dependent transporters. Nat Rev 2002;2:48–58. PMID: 11902585. DOI: 10.1038/nrc706.

36. O’Dwyer P.J., Stevenson J.P., Johnson S.W. Clinical Pharmacokinetics and administration of established platinum drugs. Drugs 2000;59:19–27. PMID: 10864227. DOI: 10.2165/00003495-200059004-00003.

37. Мартынова М.А., Бушмакина И.М., Шуканова Н.А., Молчан М.М. Влияние нанолипосомальной формы паклитаксела на злокачественные опухоли женских репродуктивных органов. Российский биотерапевтический журнал 2018;17(спецвыпуск):44. [Martynova M.A., Bushmakina I.M., Shukanova N.A., Molchan M.M. Effect of nanoliposomal Paclitaxel on tumors of female reproductive system. Rossiysky Bioterapevtichesky Zhurnal = Russian Journal of Biotherapy 2018;17(Special Issue):44. (In Russ.)].

38. Rowinsky E.K., Donehower R.C. Paclita xel(taxol). N Engl J Med 1995;332:1004–14. PMID: 7885406. DOI: 10.1056/NEJM199504133321507.

39. Cortes J.E., Pazdur R. Docetaxel. J Clin Oncol 1995;13(10):2643–55. PMID: 7595719. DOI: 10.1200/JCO.1995.13.10.2643.

40. Gelmon K. The taxoids: paclitaxel and docetaxel. Lancet 1994;344:1267–72. PMID: 7967989. DOI:10.1016/s0140-6736(94)90754-4.

41. Von Hoff D.D., Ervin T., Arena F.P. et al. Increased survival in pancreatic cancer with nab-paclitaxel plus gemcitabine. N Engl J Med 2013;369:1691–703. PMID: 24131140. DOI: 10.1056/NEJMoa1304369.

42. Gogas H., Bafaloukos D., Bedikian A.Y. The role of taxanes in the treatment of metastatic melanoma. Melanoma Res 2004;14:415–20. PMID: 15457099. DOI: 10.1097/00008390-200410000-00013.

43. Шпрах З.С., Игнатьева Е.В., Ярцева И.В. Валидация методики количественного определения аранозы в лекарственной форме. Российский биотерапевтический журнал 2018;17(спецвыпуск):84. [Shprakh Z.S., Ignateva E.V., Yartceva I.V. Validation of the method of quantitative determination of Aranose in a dosage form. Rossiysky Bioterapevtichesky Zhurnal = Russian Journal of Biotherapy 2018;17(Special Issue): 84. (In Russ.)].

44. Шпрах З.С., Игнатьева Е.В., Ярцева И.В. Разработка и валидация методики количественного определения аранозы в лекарственной форме. Российский биотерапевтический журнал 2018;17(2):57–62. DOI: 10.17650/1726-9784-2018-17-2-57-62. [Shprakh Z.S., Ignateva E.V., Yartseva I.V. Development and validation of aranosa assay in the dosage form. Rossiysky Bioterapevtichesky Zhurnal = Russian Journal of Biotherapy 2018;17(2):57–62. (In Russ.)].

45. Афанасьева Д.А., Барышникова М.А., Бурова О.С. и др. Активация инициаторных каспаз-8 и -9 под влиянием лекарственных форм аранозы. Российский биотерапевтический журнал 2016;15(1):7. [Afanasieva D.A., Baryshnikova M.A., Burova O.S. et al. Activation of initiator caspase-8 and -9 by aranose drug formulations. Rossiysky Bioterapevtichesky Zhurnal = Russian Journal of Biotherapy 2016;15(1):7. (In Russ.)].

46. Полозкова С.А., Горбунова В.А., Орел Н.Ф. Эффективность и токсичность комбинации аранозы и доксорубицином при метастатических нейроэндокринных неоплазиях. Российский биотерапевтический журнал 2016;15(1):88. [Polozkova S.A., Gorbunova V.A., Orel N.F. Effect and toxicity of Aranose and Doxorubicin combination on metastatic neuroendocrine tumors. Rossiysky Bioterapevtichesky Zhurnal = Russian Journal of Biotherapy 2016;15(1):88. (In Russ.)].

47. Полозкова С.А., Горбунова В.А., Делекторская В.В. и др. Факторы прогноза эффективности терапии нейроэндокринных новообразований режимами на основе Аранозы. Российский биотерапевтический журнал 2017;16(1):38–46. DOI: 10.17650/1726-9784-2017-16-1-38-46. [Polozkova S.A., Gorbunova V.A., Delektorskaya V.V. et al. Prognostic factors of the efficacy of aranoza-bazed therapy in neuroendocrine neoplasms. Rossiysky Bioterapevtichesky Zhurnal = Russian Journal of Biotherapy 2017;16(1):38–46 (In Russ.)].

48. Пономарев А.В., Мисюрин В.А., Рудакова А.А. и др. Изменение экспрессии мРНК MDM2 и NFkB1 в клеточных линиях меланомы человека при воздействии 2 лекарственных форм аранозы. Российский биотерапевтический журнал 2017;16(3):52–8. DOI: 10.17650/1726-9784-2017-16-3-52-58. [Ponomarev A.V., Misyurin V.A., Rudakova A.A. et al. The influence of drug formulations on the expression of MDM2 and NFkB1 mRNA in the melanoma cell lines Rossiysky Bioterapevtichesky Zhurnal = Russian Journal of Biotherapy 2017;16(3):52–8. (In Russ.)].

49. Харкевич Г.Ю., Егоров Г.Н., Манзюк Л.В. и др. Отечественные нитрозопроизводные в лечении меланомы кожи. Российский биотерапевтический журнал 2003;2(1):49–53. [Kharlevich G. Yu, Egorov G.N., Manzyuk L.V. et al. Russian nitrosoureas in skin melanoma therapy. Rossiysky Bioterapevtichesky Zhurnal = Russian Journal of Biotherapy 2003;2(1):49–53. (In Russ.)].

50. Михайлова И.Н., Лукашина М.И., Барышников А.Ю. и др. Клеточные линии меланомы – основа для создания противоопухолевых вакцин. Вестник РАМН 2005;76:37–40. [Mikhailova I.N., Lukashina M.I., Baryshnikov A.Yu., et al. Melanoma cell lines as the basis for antitumor vaccine preparation. Bulletin of RAMS = Annals of the Russian academy of medical sciences 2005;7:37–40.(In Russ.).].

51. Михайлова И.Н., Ковалевский Д.А., Бурова О.С. и др. Экспрессия раково-тестикулярных антигенов в клетках меланомы человека. Сибирский онкологический журнал 2010;37(1):29–39. [Mikhaylova I.N., Kovalevsky D.A., Burova O.S. Expression of Cancer Testis Antigens in Human Melanoma. Sibirskiy oncologicheskii journal = Siberian journal of Oncology 2010;37(1):29–39. (In Russ.)].

52. Рябая О.О., Цыганова И.В., Сидорова Т.И. и др. Влияние активирующих мутаций V600 гена B-RAF на способность клеток меланомы к аутофагии. Саркомы костей, мягких тканей и опухоли кожи 2013;3:68–72. [Ryabaya O.O., Tsyganova I.V., Sidorova Т.А. et al. Effect of Activating V600 mutations of the B-RAF gene on the ability of melanoma cells to autophagy. Sarkomy kostey, myagkikh tkaney i opukholi kozhi = Sarkomas of Bones, Soft Tissues and Skin Tumors 2013;(3):68–72. (In Russ.)].

53. Пономарев А.В., Солодовник А.А., Мкртчян А.С. и др. Связь делеций и точечных мутаций гена р53 с резистентностью клеточных линий метастатической меланомы кожи к аранозе. Российский биотерапевтический журнал 2018;17(1):64–9. DOI: 10.17650/1726-9784-2018-17-1-64-69. [Ponomarev A.V., Solodovnik A.A., Mkrtchyan A.S. et al. Relationship between deletion and point mutations of p53 and drug resistance to aranoza in human melanoma cell lines. Rossiysky Bioterapevtichesky Zhurnal = Russian Journal of Biotherapy 2018;17(1):64–9. (In Russ.)].

54. Chomczynski P., Sacchi N. The singlestep method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenolchloroform extraction. Anal Biochem 1987;1(2):581–5. PMID: 2440339. DOI: 10.1006/abio.1987.9999.

55. Moore F.R., Rempfer C.B., Press R.D. Quantitative BCR-ABL1 RQ-PCR fusion transcript monitoring in chronic myelogenous leukemia. Methods Mol Biol 2013;999:1–23. PMID: 23666687. DOI: 10.1007/978-1-62703-357-2_1.