Preview

Российский биотерапевтический журнал

Расширенный поиск

Создание иммунофлуоресцентных зондов для анализа клеточных популяций методом проточной цитометрии на базе моноклональных антител серии ICO с фикоэритрином - флуорофором группы фикобилипротеинов

https://doi.org/10.17650/1726-9784-2019-18-3-39-47

Полный текст:

Аннотация

Введение. Флуоресцентные зонды на основе моноклональных антител (МКА) широко используются в научных и клинических исследованиях в области онкологии, гематологии, иммунологии, эпидемиологии. Уникальные спектральные свойства природного белка фикоэритрина (PE) сделали его доминирующим флуорофором, широко используемым для создания флуоресцентных зондов на основе МКА.

Цель работы — создание иммунофлуоресцентных зондов (ИФЗ) на основе МКА и флуоресцентного красителя фикоэритрина двумя альтернативными методами белковой химии.

Материалы и методы. В работе были использованы антитела к антигенам T-лимфоцитов (клон ICO-86, клон ICO-31), флуоресцентный краситель фикоэритрин и бифункциональные агенты SPDP и SMCC. Для выделения и очистки МКА использовали методы жидкостной хроматографии: на Iэтапе — аффинное выделение иммуноглобулинов на иммобилизованном белке G или в качестве альтернативы — анионообменную колоночную хроматографию. Для очистки конъюгатов (ИФЗ) от исходных компонентов реакции использовали гель-фильтрацию на колонке PD-10. Концентрацию и плотность мечения ИФЗ определяли спектрофотометрически.

Результаты. Конъюгирование МКА с PE проводили при молярном отношении компонентов 1: 2. Мы использовали 2 метода белковой химии для получения конъюгатов на основе МКА с PE. Для этого оба компонента реакции конъюгации — PE и МКА — предварительно были раздельно модифицированы. Показано, что для создания ИФЗ на базе МКА серии ICO применимы оба приведенных метода конъюгирования МКА с РЕ, однако метод II, при котором химической модификации бифункциональным агентом SMCC подвергается только молекула PE по ее свободным аминогруппам, а молекула иммуноглобулина сохраняется в максимально нативном состоянии, исключая дозированное восстановление части дисульфидных групп, является предпочтительным.

Заключение. Способы, описанные в статье, позволяют получать ИФЗ на основе МКА серии ICO и РЕ, сравнимые по своим аналитическим характеристикам с зарубежными коммерческими аналогами.

Об авторах

А. С. Гриневич
Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Блохина Минздрава России
Россия
115478 Москва, Каширское ш., 24.


М. Н. Краева
Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Блохина Минздрава России
Россия
115478 Москва, Каширское ш., 24.


Е. Н. Захарова
Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Блохина Минздрава России
Россия
115478 Москва, Каширское ш., 24.


Д. Ю. Блохин
Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Блохина Минздрава России
Россия
115478 Москва, Каширское ш., 24.


П. К. Иванов
Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Блохина Минздрава России
Россия
115478 Москва, Каширское ш., 24.


Список литературы

1. Копырулина М.Е., Захарова Е.Н., Заботина Т.Н. и др. Технология создания и свойства иммунофлуоресцентных зондов с меткой Alexa-488 для анализа клеточных популяций методом проточной цитометрии. Российский биотерапевтический журнал 2018;17(1):70— 5. DOI: 10.17650/1726-9784-2018-17-1-70-75.

2. Parks D.R., Herzenberg L.A. Fluorecsence-activated cell sorting: theory, experimental optimization, and application in jymphoid cell biology. Methods Enzymol 1984;108:197-241. DOI: 10.1016/s0076-6879(84)08086-1.

3. Oi V.T., Glazer A.N., Stryer L. Fluorescent phycobiliprotein conjugates for analyses of cells and molecules. J Cell Biol 1982;93(3):981—6. DOI: 10.1083/jcb.93.3.981.

4. Kronick M.N., Grossman P.D. Immunoasay tehniques with flourescent phycobiliprotein conjugates. Clin Chem 1983;29(9):1582-6.

5. Haugland R.P. Handbook of fluorescent probes and research products. 9th edn. Eugene, OR. Molecular Probes 2002; 1.3.

6. Hardy R.R., Weir D.M., Herzenberg L.A. et al. Purification and coupling of fluorescent proteins for use in flow cytometry. In: Handbook of Experimental Immunology, 4th edn. Boston: Blackwell Scientific Publications, 1986.

7. Mahmoudian J., Jeddi-Tehrani M., Hodjattallah Rabbani H. Conjugation of r-phycoerythrin to a polyclonal antibody and f(ab’)2 fragment of a polyclonal antibody by two different methods. Avicenna J Med Biotechnol 2010;2(2):87—91.

8. Хайдуков С.В. Подходы к стандартизации метода проточной цитометрии для иммунофенотипирования. Настройка цитометров и подготовка протоколов для анализа. Медицинская иммунология 2007;9(6):569—74.


Для цитирования:


Гриневич А.С., Краева М.Н., Захарова Е.Н., Блохин Д.Ю., Иванов П.К. Создание иммунофлуоресцентных зондов для анализа клеточных популяций методом проточной цитометрии на базе моноклональных антител серии ICO с фикоэритрином - флуорофором группы фикобилипротеинов. Российский биотерапевтический журнал. 2019;18(3):39-47. https://doi.org/10.17650/1726-9784-2019-18-3-39-47

For citation:


Grinevich A.S., Kraeva M.N., Zakharova E.N., Blokhin D.Y., Ivanov P.K. The creation of immunofluorescence probes based on monoclonal antibodies series ICO and phycoerythrin - fluorophore of phycobiliprotein group for analysis of cell populations by flow cytometry. Russian Journal of Biotherapy. 2019;18(3):39-47. (In Russ.) https://doi.org/10.17650/1726-9784-2019-18-3-39-47

Просмотров: 22


Creative Commons License
Контент доступен под лицензией Creative Commons Attribution 4.0 License.


ISSN 1726-9784 (Print)
ISSN 1726-9792 (Online)