Создание иммунофлуоресцентных зондов для анализа клеточных популяций методом проточной цитометрии на базе моноклональных антител серии ICO с фикоэритрином - флуорофором группы фикобилипротеинов

Введение. Флуоресцентные зонды на основе моноклональных антител (МКА) широко используются в научных и клинических исследованиях в области онкологии, гематологии, иммунологии, эпидемиологии. Уникальные спектральные свойства природного белка фикоэритрина (PE) сделали его доминирующим флуорофором, широко используемым для создания флуоресцентных зондов на основе МКА.

Цель работы — создание иммунофлуоресцентных зондов (ИФЗ) на основе МКА и флуоресцентного красителя фикоэритрина двумя альтернативными методами белковой химии.

Материалы и методы. В работе были использованы антитела к антигенам T-лимфоцитов (клон ICO-86, клон ICO-31), флуоресцентный краситель фикоэритрин и бифункциональные агенты SPDP и SMCC. Для выделения и очистки МКА использовали методы жидкостной хроматографии: на Iэтапе — аффинное выделение иммуноглобулинов на иммобилизованном белке G или в качестве альтернативы — анионообменную колоночную хроматографию. Для очистки конъюгатов (ИФЗ) от исходных компонентов реакции использовали гель-фильтрацию на колонке PD-10. Концентрацию и плотность мечения ИФЗ определяли спектрофотометрически.

Результаты. Конъюгирование МКА с PE проводили при молярном отношении компонентов 1: 2. Мы использовали 2 метода белковой химии для получения конъюгатов на основе МКА с PE. Для этого оба компонента реакции конъюгации — PE и МКА — предварительно были раздельно модифицированы. Показано, что для создания ИФЗ на базе МКА серии ICO применимы оба приведенных метода конъюгирования МКА с РЕ, однако метод II, при котором химической модификации бифункциональным агентом SMCC подвергается только молекула PE по ее свободным аминогруппам, а молекула иммуноглобулина сохраняется в максимально нативном состоянии, исключая дозированное восстановление части дисульфидных групп, является предпочтительным.

Заключение. Способы, описанные в статье, позволяют получать ИФЗ на основе МКА серии ICO и РЕ, сравнимые по своим аналитическим характеристикам с зарубежными коммерческими аналогами.

1. Копырулина М.Е., Захарова Е.Н., Заботина Т.Н. и др. Технология создания и свойства иммунофлуоресцентных зондов с меткой Alexa-488 для анализа клеточных популяций методом проточной цитометрии. Российский биотерапевтический журнал 2018;17(1):70— 5. DOI: 10.17650/1726-9784-2018-17-1-70-75.

2. Parks D.R., Herzenberg L.A. Fluorecsence-activated cell sorting: theory, experimental optimization, and application in jymphoid cell biology. Methods Enzymol 1984;108:197-241. DOI: 10.1016/s0076-6879(84)08086-1.

3. Oi V.T., Glazer A.N., Stryer L. Fluorescent phycobiliprotein conjugates for analyses of cells and molecules. J Cell Biol 1982;93(3):981—6. DOI: 10.1083/jcb.93.3.981.

4. Kronick M.N., Grossman P.D. Immunoasay tehniques with flourescent phycobiliprotein conjugates. Clin Chem 1983;29(9):1582-6.

5. Haugland R.P. Handbook of fluorescent probes and research products. 9th edn. Eugene, OR. Molecular Probes 2002; 1.3.

6. Hardy R.R., Weir D.M., Herzenberg L.A. et al. Purification and coupling of fluorescent proteins for use in flow cytometry. In: Handbook of Experimental Immunology, 4th edn. Boston: Blackwell Scientific Publications, 1986.

7. Mahmoudian J., Jeddi-Tehrani M., Hodjattallah Rabbani H. Conjugation of r-phycoerythrin to a polyclonal antibody and f(ab’)2 fragment of a polyclonal antibody by two different methods. Avicenna J Med Biotechnol 2010;2(2):87—91.

8. Хайдуков С.В. Подходы к стандартизации метода проточной цитометрии для иммунофенотипирования. Настройка цитометров и подготовка протоколов для анализа. Медицинская иммунология 2007;9(6):569—74.