Разработка тест-системы на основе иммуноферментного анализа для детекции рекомбинантного пневмолизина Streptococcus pneumoniae

Введение. Пневмолизин (Ply) – гемолитический токсин Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae), экспрессируемый всеми штаммами пневмококка. Для его качественного и количественного определения в биологических жидкостях простым, быстрым и эффективным способом может быть использование сэндвич-ИФА (иммуноферментного анализа).

Цель исследования – разработать и оценить специфичность сэндвич-ИФА тест-системы для качественного и количественного определения рекомбинантного Ply (rPly) S. pneumoniae.

Материалы и методы. В качестве распознающих антител в сэндвич-ИФА использовали кроличьи поликлональные антитела (ПкАТ) к rPly, иммобилизованные на твердой фазе. К ПкАТ (rPly) прибавляли исследуемые антигены (АГ). Реакцию проявляли детектирующими мышиными моноклональными иммуноглобулинами – IgG1 (rPly) – антителами, конъюгированными с пероксидазой корня хрена. Специфичность тест-системы оценивали при использовании в качестве референс-препаратов рекомбинантного α-гемолизина (rα-Hly) и водорастворимых АГ Staphylococcus aureus (S. aureus).

Результаты. С помощью сэндвич-ИФА rPly выявлен в концентрации 0,15 мкг / мл. Тест-система характеризовалась специфичностью, что подтверждено отсутствием реакции с rα-Hly S. aureus. Референс-препараты водорастворимых поверхностных АГ штаммов S. aureus № 209, 1986, 1991 и Cowan I давали ложноположительную реакцию за счет присутствия в их составе протеина А (SpA) – термостабильного поверхностного белка, экспрессируемого многими штаммами стафилококка, способного связывать иммуноглобулины через Fc-фрагмент или Fabфрагменты V3H домена В-клеточного рецептора. Отрицательная реакция получена с АГ из штамма S. aureus wood 46, не имеющего гена spa, кодирующего экспрессию SpA. Присутствие SpA в препаратах водорастворимых АГ S. aureus подтверждено в реакции ингибирования при ИФА.

Заключение. Разработан сэндвич-ИФА для качественного и количественного определения Ply S. pneumoniae. Проведенные исследования подтвердили специфичность тест-системы.

1. Grousd J.A., Rich H.E., Alcorn J.F. Host-pathogen interactions in gram-positive bacterial pneumonia. Clin Microbiol Rev 2019; 32:e00107-18. DOI: 10.1128/CMR.00107-18

2. Hageman J.C, Uyeki T.M, Francis J.S. et al. Severe community-acquired pneumonia due to Staphylococcus aureus, 2003-04 influenza season. Emerg Infect Dis 2006;12:894–9. DOI: 10.3201/eid1206.051141

3. Jahn K., Kohler T.P., Hammerschmidt S. et al. Bacterial adhesins and the pneumococcus. Cells 2022;11:1121. DOI: 10.3390/cells11071121

4. Cockeran R., Anderson R., Feldman C. The role of pneumolysin in the pathogenesis of Streptococcus pneumoniae infection. Curr Opin Infect Dis 2022;15(3):235–9. DOI: 10.1097/00001432-200206000-00004

5. Bubeck Wardenburg J., Bae T., Otto M. et al. Poring over pores: Alpha-hemolysin and panton-valentine leukocidin in Staphylococcus aureus pneumonia. Nat Med 2022;13(12): 1405–6. DOI: 10.1038/nm1207-1405

6. Kebaier C., Chamberland R.R., Allen I.C. et al. Staphylococcus aureus alpha-hemolysin mediates virulence in a murine model of severe pneumonia through activation of the NLRP3 inflammasome. J Infect Dis 2012;205(5):807–17. DOI: 10.1093/infdis/jir846

7. Cohen T.S., Jones-Nelson O., Hotz M. et al. S. aureus blocks efferocytosis of neutrophils by macrophages through the activity of its virulence factor alpha toxin. Sci Rep 2016;6:35466. DOI: 10.1038/srep35466

8. Kitur K., Parker D., Nieto P. et al. Toxin-induced necroptosis is a major mechanism of Staphylococcus aureus lung damage. PLoS Pathog 2015;11(4):e1004820. DOI: 10.1371/journal.ppat.1004820

9. Mitchell T.J., Dalziel C.E. The biology of pneumolysin. Subcell Biochem 2014;80:145–60. DOI: 10.1007/978-94-017-8881-6_8

10. Gingerich A.D., Mousa J.J. Diverse mechanisms of protective anti-pneumococcal antibodies. Front Cell Infect Microbiol 2022;12:824788. DOI: 10.3389/fcimb.2022.824788

11. Wheeler J., Freeman R., Steward M. et al. Detection of pneumolysin in sputum. J Med Microbiol 1999;48(9):863–6. DOI: 10.1099/00222615-48-9-863.8

12. Rajalakshmi B., Kanungo R., Srinivasan S., Badrinath S. Pneumolysin in urine: A rapid antigen detection method to diagnose pneumococcal pneumonia in children. Indian J Med Microbiol 2002;20(4):183–6. PMID: 17657067

13. Matos J.A., Madureira D.J., Rebelo М.С. et al. Diagnosis of Streptococcus pneumoniae meningitis by polymerase chain reaction amplification of the gene for pneumolysin. Mem Inst Oswaldo Cruz 2006;101(5):559–63. DOI: 10.1590/s0074-02762006000500014

14. Lahti E., Mertsola J., Kontiokari T. et al. Pneumolysin polymerase chain reaction for diagnosis of pneumococcal pneumonia and empyema in children. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2006;25(12):783–9. DOI: 10.1007/s10096-006-0225-9

15. Becker R.E., Berube B.J., Sampedro G.R. Tissue-specific patterning of host innate immune responses by Staphylococcus aureus alpha-toxin. J Innate Immun 2014;6(5):619–631. DOI: 10.1159/000360006

16. Song L., Hobaugh M.R., Shustak C. et al. Structure of staphylococcal alpha-hemolysin, a heptameric transmembrane pore. Science 1996;274(5294):1859–66. DOI: 10.1126/science.274.5294.1859

17. Воробьев Д.С., Сидоров А.В., Калошин А.А. и др. Получение рекомбинантной формы белка пневмолизина Streptococcus pneumoniae. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины 2022;174(12):723–7. DOI: 10.47056/0365-9615-2022-174-12-723-727

18. Воробьев Д.С., Сидоров А.В., Калошин А.А. и др. Рекомбинантная плазмидная ДНК pSp-raPLY, кодирующая синтез рекомбинантного атоксичного белка пневмолизина Streptococcus pneumoniae, штамм Escherichia coli M15/pSp-raPLY – продуцент рекомбинантной атоксичной формы пневмолизина и получение указанного белка для разработки вакцинного препарата для профилактики пневмококковых инфекций. Патент РФ №2782598 от 31.10.2022.

19. Broecker F., Anish C., Seeberger P.H. Generation of monoclonal antibodies against defined oligosaccharide antigens. Methods Mol Biol 2015;1331:57–80. DOI: 10.1007/978-1-4939-2874-3_5

20. Nakane P.K., Kawaoi A. Peroxidase-labeled antibody. A new method of conjugation. J Histochem Cytochem 1974;22(12):1084–91. DOI: 10.1177/22.12.1084

21. Segel I.H. Biochemical calculations: How to solve mathematical problems in general biochemistry. New-York, London, Sydney, Toronto: John Wiley & Sons Inc., 1976; 441 p.

22. Levinson A.I., Tar L., Carafa C., Haidar M. Potent stimulus of immunoglobulin M rheumatoid factor production. J Clin Invest 1986;78(3):612–7. DOI: 10.1172/JCI112617

23. Falugi F., Kim H.K., Missiakas D.M., Schneewind O. The role of protein A in the evasion of host adaptive immune responses by Staphylococcus aureus. mBio 2013; 4(5):e00575-13. DOI: 10.1128/mBio.00575-13

24. Rigi G., Ghaedmohammadi S., Ahmadian G.A. Сomprehensive review on staphylococcal protein A (SpA): Its production and applications. Biotechnol Appl Biochem 2019;66(3):454–64. DOI: 10.1002/bab.1742

25. Balachandran M., Giannone R.J., Bemis D.A., Kania S.A. Molecular basis of surface anchored protein A deficiency in the Staphylococcus aureus strain Wood 46. PLoS One 2017;12(8):e0183913. DOI: 10.1371/journal.pone.0183913