Цитопатогенное действие нативного пневмолизина Streptococcus pneumoniae на клетки линии CHO-K1

Введение. Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae, пневмококк) – условно-патогенные бактерии, вызывающие воспалительные заболевания у человека. Одним из факторов вирулентности S. pneumoniae является пневмолизин (Ply) – холестеролзависимый гемолитический токсин, который при взаимодействии с холестерином клеточных мембран эукариотов формирует поры и приводит к разрушению и гибели клеток.

Цель исследования – иммунохимическая характеристика Ply и оценка его цитотоксического действия в культуре клеток яичника китайского хомячка CHO-K1.

Материалы и методы. Для получения Ply штамм S. pneumoniae серотипа 3 культивировали в сердечно-мозговом бульоне, осаждали бактериальные клетки центрифугированием и подвергали ультразвуковой дезинтеграции. Наличие Ply в полученном препарате подтверждали с помощью иммуноблоттинга с моноклональными антителами к рекомбинантному Ply. Цитопатогенное действие Ply исследовали на культуре пролинзависимых эпителиоподобных клеток яичника китайского хомячка CHO-К1 в среде RPMI-1640. Гемолитическую активность Ply оценивали в реакции с эритроцитами мыши.

Результаты. Методом ультразвуковой дезинтеграции клеток штамма S. pneumoniae серотипа 3 с последующим осаждением сульфатом аммония получен белок, образующий на электрофорезе полосу, соответствующую молекулярной массе Ply (53 кДа). Полученный белок обладал способностью лизировать эритроциты мыши. Подлинность Ply подтверждена в иммуноблоттинге с моноклональными антителами к рекомбинантному Ply. Ply оказывал цитопатогенное действие на клетки яичника китайского хомячка CHO-K1. Минимальная доза препарата, индуцирующая токсическое действие на  клетки, проявляющаяся в появлении наряду с нормальными клетками округлых и мелких клеток, составляла 16,4 мкг/мл по белку. При увеличении концентрации до 65,6 мкг/мл обнаруживали только мелкие круглые клетки. Дальнейшее увеличение концентрации приводило к полной деструкции клеток CHO-K1.

Заключение. Пневмолизин можно использовать для разработки новых лекарственных средств, предназначенных для терапии пневмококковых инфекций.

1. Andre G.O., Converso T.R., Politano W.R. et al. Role of Streptococcus pneumoniae proteins in evasion of complementmediated immunity. Front Microbiol 2017;8:224. DOI: 10.3389/fmicb.2017.00224

2. Briles D.E., Paton J.C., Mukerji R. et al. Pneumococcal vaccines. Microbiol Spectr 2019;7(6). DOI: 10.1128/microbiolspec.GPP3-0028-2018

3. Croucher N.J., Løchen A., Bentley S.D. Pneumococcal vaccines: Host interactions, population dynamics, and design principles. Annu Rev Microbiol 2018;72:521–49. DOI: 10.1146/annurev-micro-090817-062338

4. Gonzalez-Juarbe N., Bradley K.M., Riegler A.N. et al. Bacterial pore-forming toxins promote the activation of caspases in parallel to necroptosis to enhance alarmin release and inflammation during pneumonia. Sci Rep 2018;8(1):5846. DOI: 10.1038/s41598-018-24210-8

5. Nishimoto A.T., Rosch J.W., Tuomanen E.I. Pneumolysin: Pathogenesis and therapeutic target. Front Microbiol 2020;11:1543. DOI: 10.3389/fmicb.2020.01543

6. Pereira J.M., Xu S., Leong J.M., Sousa S. The yin and yang of pneumolysin during pneumococcal infection. Front Immunol 2022;13:878244. DOI: 10.3389/fimmu.2022.878244

7. Cima Cabal M.D., Molina F., López-Sánchez J.I. et al. Pneumolysin as a target for new therapies against pneumococcal infections: A systematic review. PLoS One 2023;18(3):e0282970. DOI: 10.1371/journal.pone.0282970

8. Wu J., Wu K., Xu W. et al. Engineering detoxified pneumococcal pneumolysin derivative ΔA146PLY for self-biomineralization of calcium phosphate: Assessment of their protective efficacy in murine infection models. Biomaterials 2018;155:152–64. DOI: 10.1016/j.biomaterials.2017.11.018

9. Rosano G.L., Ceccarelli E.A. Recombinant protein expression in Escherichia coli: Advances and challenges. Front Microbiol 2014;5:172. DOI: 10.3389/fmicb.2014.00172

10. Segel I.H. Biochemical calculations: How to solve mathematical problems in general biochemistry. New-York, London, Sydney, Toronto: John Wiley & Sons Inc., 1976. 441 p.

11. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 1970;227(5259):680–5. DOI: 10.1038/227680a0

12. Burnette W.N. “Western blotting”: electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate – polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Anal Biochem 1981;112(2):195–203. DOI: 10.1016/0003-2697(81)90281-5

13. Vorobyev D.S., Sidorov A.V., Kaloshin A.A. et al. Preparation a recombinant form of pneumolysin protein from Streptococcus pneumoniae. Bull Exp Biol Med 2023;174(6):749–53. DOI: 10.1007/s10517-023-05785-3

14. Ketelut-Carneiro N., Fitzgerald K.A. Apoptosis, pyroptosis, and necroptosis-Oh My! The many ways a cell can die. J Mol Biol 2022; 434(4):167378. DOI: 10.1016/j.jmb.2021.167378