Действие штамма Р-92 реовируса человека на опухолевые клеточные линии

Введение. Среди всех новых методов и подходов высокую эффективность в различных фазах клинических испытаний и хорошую переносимость пациентами показывает виротерапия онколитическими вирусами как в сочетании с иммунотерапией, так и без нее.

Цель – исследовать чувствительность некоторых иммортализованных клеточных линий рака к штамму Р-92 реовируса человека с характеристикой клеток на ультраструктурном уровне.

Материалы и методы. Исследование проводили на клеточных линиях HeLa, А549 и U87MG. Клетки высаживали по 15 тыс. на лунку 96-луночного планшета и после адгезии проводили инокуляцию вируса внесением среды, содержащей частицы вируса в четырех 10-кратных разведениях (примерно 10 9–10 6 частиц на 1 мл), культивировали 24 ч. После чего определяли количество живых клеток в лунках непрямым способом с применением метилтетразолиевого теста. Для изучения ультраструктуры зараженных вирусом клеток культуры высевали во флакон Т25, проводили инокуляцию вирусом в максимальной концентрации. Спустя 24 ч культивирования клетки фиксировали в 2,5 % растворе глутарового альдегида на фосфатном буфере в течение 1 ч, после чего трижды отмывали в фосфатном буфере и проводили образцы для трансмиссионной электронной микроскопии (ТЭМ) по стандартной методике.

Результаты. Разведение вируса в 1000 раз приводило к снижению цитостатического эффекта во всех 3 культурах до уровня, практически не отличающегося от контроля. Наиболее чувствительной к реовирусу культурой оказалась HeLa. В экcперименте количество живых клеток сократилось до 60,4 ± 10,2 % по сравнению с контролем при инкубации с максимальным количеством вирусных частиц и до 63,7 ± 16,2 % – при 10-кратном разведении вируса. Данный показатель был достоверно ниже, чем в 2 других исследуемых культурах при данных условиях культивирования (p <0,001). Кроме того, при максимальной концентрации вируса культура А549 оказалась менее чувствительной, чем культура U87MG (p <0,01). При меньших концентрациях вирусных частиц значения средней жизнеспособности исследуемых клеточных линий достоверно не различались между собой.

Анализ электронограмм показал, что вирус успешно реплицируется в цитоплазме исследуемых культур, однако не выделяется из клетки, что связано, видимо, с коротким периодом инкубации. На ТЭМ также были видны повреждения клеток, характерные для апо- или некроптоза, однотипно выраженные во всех исследованных культурах.

Заключение. Клеточные линии А549, HeLa и U87MG по результатам метилтетразолиевого теста демонстрируют разную чувствительность к штамму реовируса человека Р-92. Картина ТЭМ клеток зараженных культур продемонстрировала признаки развития апо- или некроптоза.

1. Состояние онкологической помощи населению России в 2021 году. Под ред. А.Д. Каприна, В.В. Старинского, А.О. Шахзадовой. М.: МНИОИ им. П.А. Герцена – филиал ФГБУ «НМИЦ радиологии» Минздрава России, 2022. 239 с.

2. Тимошкина Н.Н., Богомолова О.А., Жужеленко И.А. и др. Исследование полиморфизмов генов UGT1A1 и DPYD у пациентов с колоректальным раком. Сибирский онкологический журнал 2018;17(6):49–56. DOI: 10.21294/1814-4861-2018-17-6-49-56

3. Lin D., Shen Y., Liang T. Oncolytic virotherapy: basic principles, recent advances and future directions. Signal Transduct Target Ther 2023;8(1):156. DOI: 10.1038/s41392-023-01407-6

4. Вдовиченко Г.В., Петрищенко В.А., Сергеев А.А. и др. Доклинические исследования противоракового лечебного аденовирусного препарата канцеролизин. Вопросы вирусологии 2006;51(6):39–42. PMID: 17214082

5. Желтухин А.О., Соболева А.В., Сосновцева А.О. и др. Энтеровирусы человека проявляют избирательную онколитическую активность на модели ксенотрансплантатов мультиформной глиобластомы человека в иммунодефицитных мышах. Вестник РГМУ 2018;(2):45–51. DOI: 10.24075/vrgmu.2018.026

6. Ткачева А.В., Сиволобова Г.Ф., Гражданцева А.А. и др. Таргетная терапия глиобластомы человека с использованием онколитического потенциала парвовируса и аттенуированных штаммов вируса осповакцины. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология 2019;37(2):83–91. DOI: 10.17116/molgen20193702183

7. Кит О.И., Филиппова С.Ю., Тимофеева С.В. и др. Влияние онколитических штаммов новой неклассифицированной группы ротавирусов человека на лимфоциты периферической крови. Южно-Российский онкологический журнал 2021;2(3):23–30. DOI: 10.37748/2686-9039-2021-2-3-3

8. Ситковская А.О., Златник Е.Ю., Новикова И.А., Кит О.И. Вирус болезни Ньюкасла и иммунитет – эффективный альянс в борьбе против рака (обзор литературы). Сибирский онкологический журнал 2018;17(6):105–13. DOI: 10.21294/1814-4861-2018-17-6-105-113

9. Müller L., Berkeley R., Barr T. et al. Past, present and future of oncolytic reovirus. Cancers (Basel) 2020;12(11):3219. DOI: 10.3390/cancers12113219

10. Колпаков С.А. Новые эритроцитарные тест-системы для выявления вирусов различных антигенных групп, разработанные в Ростовском НИИ: опыт использования и дальнейшие перспективы. В кн.: Профилактика инфекционных заболеваний на рубеже XXI века: сб. науч. тр. Хабаровск, 2001. С. 305–12.

11. Ситковская А.О., Златник Е.Ю., Межевова И.В. и др. Влияние онколитического реовируса Р-92 на созревание дендритных клеток и генерацию опухолеспецифических Т-лимфоцитов in vitro. Цитология 2019;61(7):529–35. DOI: 10.1134/S0041377119070095

12. Кит О.И., Златник Е.Ю., Новикова И.А. и др. Способ стимуляции презентирующей активности дендритных клеток: патент № 2728592 C1 Российская Федерация, МПК C12Q 1/68, A61K 31/00 от 30.07.2020.

13. Ситковская А.О., Златник Е.Ю., Новикова И.А. и др. Исследование возможности онколитических эффектов in vitro вирусов из семейств Reoviridae и Paramyxoviridae. Известия вузов. Северо-Кавказский регион. Естественные науки 2018;4(200):124–30. DOI: 10.23683/0321-3005

14. Фрешни Р.Я. Культура животных клеток. Практическое руководство. Пер. с 5-го англ. изд-я. М.: Бином; Лаборатория знаний, 2011.

15. Graham L., Orenstein J. Processing tissue and cells for transmission electron microscopy in diagnostic pathology and research. Nat Protoc 2007;2(10):2439–50. DOI: 10.1038/nprot.2007.304

16. Lu M., Liao F. Interferon-stimulated gene ISG12b2 is localized to the inner mitochondrial membrane and mediates virus-induced cell death. Cell Death Differ 2011;18(6):925–36. DOI: 10.1038/cdd.2010.160

17. McNamara A., Roebke K., Danthi P. Cell killing by reovirus: mechanisms and consequences. Curr Top Microbiol Immunol 2023;442:133–53. DOI: 10.1007/82_2020_225

18. Fernandes J.P., Cristi F., Eaton H.E. et al. Breast tumorassociated metalloproteases restrict reovirus oncolysis by cleaving the σ1 cell attachment protein and can be overcome by mutation of σ1. J Virol 2019;93(22):e01380-19. DOI: 10.1128/JVI.01380-19

19. Fernández de Castro I., Risco C. Imaging RNA virus replication assemblies: Bunyaviruses and reoviruses. Fut Virol 2014;9(12):1089–104. DOI: 10.2217/fvl.14.95

20. Fernández de Castro I., Zamora P.F., Ooms L. et al. Reovirus forms neo-organelles for progeny particle assembly within reorganized cell membranes. mBio 2014;5(1):e00931-13. DOI: 10.1128/mBio.00931-13

21. Kniert J., Dos Santos T., Eaton H.E. et al. Reovirus uses temporospatial compartmentalization to orchestrate core versus outercapsid assembly. PLoS Pathog 2022;18(9):e1010641. DOI: 10.1371/journal.ppat.1010641

22. Shah P.N.M., Stanifer M.L., Höhn K. et al. Genome packaging of reovirus is mediated by the scaffolding property of the microtubule network. Cell Microbiol 2017;19(12):10. DOI: 10.1111/cmi.12765

23. Tenorio R., Fernández de Castro I., Knowlton J. et al. Reovirus σNS and µNS proteins remodel the endoplasmic reticulum to build replication neo-organelles. mBio 2018;9(4):e01253-18. DOI: 10.1128/mBio.01253-18

24. Golla N., Hong L.J., Chefetz I. Visualization of necroptotic cell death through transmission electron microscopy. Methods Mol Biol 2021;2255:135–47. DOI: 10.1007/978-1-0716-1162-3_12

25. Хаитов Р.М. Иммунология. 3-е изд., перераб. и доп. М.: ГЭОТАР-Медиа, 2018. 496 с.

26. Galluzzi L., Vitale I., Warren S. et al. Consensus guidelines for the definition, detection and interpretation of immunogenic cell death. J Immunother Cancer 2020;8(1):e000337. DOI: 10.1136/jitc-2019-000337