Нейтрализующая способность моноклональных антител, направленных к эпитопам функционально значимого домена пневмолизина Streptococcus pneumoniae

Введение. Пневмолизин (Ply) – бактериальный холестеролзависимый цитолизин, продуцируемый практически всеми штаммами Streptococcus pneumoniae. Антитела, индуцированные к Ply, способны в определенной степени нейтрализовать его патогенное действие на клетки.

Цель исследования – изучить действие моноклональных антител (МкАт), полученных к нативной (натPly) и рекомбинантной (рекPly) формам Ply, на нейтрализацию цитолитической активности бактериального Ply in vitro и их превентивные свойства при заражении мышей вирулентным штаммом S. pneumoniae.

Материалы и методы. МкАт к натPly- и рекPly-форме получали из асцитной жидкости мышей. Поликлональные антитела ПкАт (рекPly) получали из сыворотки кроликов, иммунизированных рекPly. Ингибирование гемолиза эритроцитов оценивали по минимальной концентрации МкАт (натPly), МкАт (рекPly) и ПкАт (рекPly), предотвращающей лизис эритроцитов, индуцированный натPly. Нейтрализующую способность антител оценивали на клетках яичника китайского хомячка CHO-K1 по минимальной концентрации антител, необходимых для защиты клеток от 4 цитопатогенных доз натPly. Протективные свойства антител исследовали при однократном внутрибрюшинном введении мышам 200 мкг антител с последующим заражением летальной дозой S. pneumoniae.

Результаты. Показано, что через 24 ч после внутрибрюшинного введения мышам натPly снижалась масса тела животных и появлялись дегенеративные формы эритроцитов в крови. В опытах in vitro натPly вызывал гемолиз эритроцитов и разрушение клеток CHO-K1 по механизму апоптоза. МкАт (натPly), МкАт (рекPly) и ПкАт (рекPly) ингибировали гемолиз эритроцитов и нейтрализовали разрушение клеток CHO-K1. Наиболее высокой нейтрализующей активностью характеризовались МкАт (рекPly) и ПкАт (рекPly). Однократное введение мышам исследованных антител вызывало замедление их гибели при заражении штаммом S. pneumoniae. Различий в протективной активности антител не выявлено.

Заключение. Методы, основанные на нейтрализации токсического действия Ply S. pneumoniae с помощью антител, можно рассматривать как инструмент снижения патогенности пневмококка.

1. Marshall J.E., Faraj B.H.A., Gingras A.R. et al. The crystal structure of pneumolysin at 2.0Å resolution reveals the molecular packing of the pre-pore complex. Sci Rep 2015;5:13293. DOI: 10.1038/srep13293

2. Lawrence S.L., Feil S.C., Morton C.J. et al. Crystal structure of Streptococcus pneumoniae pneumolysin provides key insights into early steps of pore formation. Sci Rep 2015;5:14352. DOI: 10.1038/srep14352

3. Vögele M., Bhaskara R.M., Mulvihill E. et al. Membrane perforation by the pore-forming toxin pneumolysin. Proc Natl Acad Sci USA 2019;116(27):13352–7. DOI: 10.1073/pnas.1904304116

4. Курбатова Е.А., Яковлева И.В., Гаврилова Н.Ф. и др. Цитопатогенное действие нативного пневмолизина Streptococcus pneumoniae на клетки линии CHO-K1. Российский биотерапевтический журнал 2024;23(1):51–7. DOI: 10.17650/1726-9784-2024-23-1-51-57.

5. Ganpule S., Vijaya A.K., Sukova A., Preta G. Membrane cholesterol content and lipid organization influence melittin and pneumolysin pore-forming activity. Toxins (Basel) 2022;14(5):346. DOI: 10.3390/toxins14050346

6. Kucinskaite-Kodze I., Simanavicius M., Dapkunas J. et al. Mapping of recognition sites of monoclonal antibodies responsible for the inhibition of pneumolysin functional activity. Biomolecules 2020;10(7):1009. DOI: 10.3390/biom10071009

7. Del Mar García-Suárez M., Cima-Cabal M.D., Flórez N. et al. Protection against pneumococcal pneumonia in mice by monoclonal antibodies to pneumolysin. Infect Immun 2004;72(8):4534–40. DOI: 10.1128/IAI.72.8.4534-4540.2004

8. De Los Toyos J.R., Méndez F.J., Aparicio J.F. et al. Functional analysis of pneumolysin by use of monoclonal antibodies. Infect Immun 1996;64(2):480–4. DOI: 10.1128/iai.64.2.480-484.1996

9. Sephalika S., Mohakud N.K., Johargy A.K. et al. Development of an immunochromatographic test strip to detect pneumolysin by monoclonal antibody capture method. Journal of King Saud University – Science 2024;36(6):103213. DOI: 10.1016/j.jksus.2024.103213

10. Cima-Cabal M.D., Méndez F.J., Vázquez F. et al. A specific and ultrasensitive chemiluminescent sandwich ELISA test for the detection and quantitation of pneumolysin. J Immunoassay Immunochem 2001;22(2):99–112. DOI: 10.1081/IAS-100103223

11. Suárez-Álvarez B., García-Suárez Mdel M., Méndez F.J., de los Toyos J.R. Characterization of mouse monoclonal antibodies for pneumolysin: Fine epitope mapping and V gene usage. Immunol Lett 2003;88(3):227–39. DOI: 10.1016/s0165-2478(03)00081-6

12. Jefferies J.M.C., Johnston C.H.G., Kirkham L.S. et al. Presence of nonhemolytic pneumolysin in serotypes of Streptococcus pneumoniae associated with disease outbreaks. J Infect Dis 2007;196(6):936–44. DOI: 10.1086/520091

13. Yakovleva I.V., Gavrilova N.F., Kurbatova E.A. et al. Immunochemical characteristics and functional activity of monoclonal antibodies obtained to the recombinant form of pneumolysin. Bull Exp Biol Med 2025;178(3):346–50. DOI: 10.1007/s10517-025-06334-w

14. Курбатова Е.А., Яковлева И.В., Гаврилова Н.Ф. и др. Разработка тест-системы на основе иммуноферментного анализа для детекции рекомбинантного пневмолизина Streptococcus pneumoniae. Российский биотерапевтический журнал 2023;22(4):52–9. DOI: 10.17650/1726-9784-2023-22-4-52-59

15. Vorobyev D.S., Sidorov A.V., Kaloshin A.A. et al. Preparation a recombinant form of pneumolysin protein from Streptococcus pneumoniae. Bull Exp Biol Med 2023;174(6):749–53. DOI: 10.1007/s10517-023-05785-3

16. Vorobyev D.S., Sidorov A.V., Ammour Y.I. et al. Analysis of toxicity of recombinant pneumolysin from Streptococcus pneumoniae. Bull Exp Biol Med 2024;177(1):137–9. DOI: 10.1007/s10517-024-06145-5

17. Broecker F., Anish C., Seeberger P.H. Generation of monoclonal antibodies against defined oligosaccharide antigens. Methods Mol Biol 2015;1331:57–80. DOI: 10.1007/978-1-4939-2874-3_5

18. Yu L., Zhu G., Zhang Z. et al. Apoptotic bodies: bioactive treasure left behind by the dying cells with robust diagnostic and therapeutic application potentials. J Nanobiotechnol 2023;21(1):218. DOI: 10.1186/s12951-023-01969-1

19. Petukhova E.S., Vorobyev D.S., Sidorov A.V. et al. Immunization with recombinant pneumolysin Induces the production of antibodies and protects mice in a model of systemic Infection caused by Streptococcus pneumoniae. Bull Exp Biol Med 2020;68(4):485–7. DOI: 10.1007/s10517-020-04736-6