Особенности экспансии и иммунофенотипа первичной культуры НК- и НКТ-клеток человека под действием различных активаторов пролиферации

Введение. Экспансия натуральных киллеров (НК) и натуральных киллеров Т-клеток (НКТ-клеток) ex vivo является важной задачей при создании химерного рецептора антигена НК- и НКТ-клеток. Наиболее часто для экспансии лимфоцитов используют моноклональные антитела (МАТ) к CD (cluster of differentiation) 3- и CD28-рецепторам. Другими хорошо изученными Т-клеточными митогенами являются L-фитогемагглютинин (L-PHA) и конканавалин А (Con-A). Перспективным, но малоизученным подходом представляется in vitro активация иммунных клеток полисахаридом фукозилированным хондроитинсульфатом (FCS), который выделен из морского огурца Cucumaria japonica и способен активировать иммунные клетки и стимулировать гемопоэз.

Цель исследования – выявление оптимального способа активации НК- и НКТ-клеток в первичной культуре мононуклеарных клеток (МНК): МАТ к CD3- и CD28-рецепторам, L-PHA, Con-A, а также комбинации МАТ к CD3- и CD28-рецепторам и FCS.

Материалы и методы. В качестве источника МНК человека использовали периферическую кровь и лейкоцитарно-тромбоцитарный концентрат. После выделения МНК проводили их активацию с помощью сорбированных МАТ к CD3- и CD28-рецепторам, L-PHA, Con-A или комбинации МАТ + FCS. Затем осуществляли культивирование лимфоцитов в присутствии интерлейкина 2, периодически оценивая прирост общего количества клеток, экспрессию поверхностных маркеров и цитотоксическую активность.

Результаты. Было показано, что L-PHA наиболее эффективно стимулировал деление Т-лимфоцитов (CD3⁺CD56^–) и НК-клеток (CD3^–CD56⁺) относительно других режимов активации: доля клеток данных популяций после активации L-PHA была наибольшей. Con-A значительно стимулировал деление Т-хелперов (CD3⁺CD4⁺). При сравнении активации клеток под воздействием МАТ относительно L-PHA и Con-A наблюдался наибольший прирост количества НКТ-клеток (CD3⁺CD56⁺). Добавление FCS при стимуляции МАТ приводило к увеличению пролиферации лимфоцитов.

Заключение. Таким образом, среди представленных способов активации МНК для стимуляции деления НК- и НКТ-клеток наиболее предпочтительным являлся способ активации МАТ + FCS, поскольку при этом наблюдался наибольший прирост общего количества клеток при максимальной доле CD56⁺-лимфоцитов, составляющей 58,9 % к концу срока культивирования.

1. Боробова Е.А., Жеравин А.А. Натуральные киллеры в иммунотерапии онкологических заболеваний. Сибирский онкологический журнал 2018;17(6):97–104. DOI: 10.21294/1814-4861-2018-17-6-97-104

2. Wik J.A., Skålhegg B.S. T cell metabolism in infection. Front Immunol 2022;13:840610. DOI: 10.3389/fimmu.2022.840610

3. Rafiq S., Hackett C.S., Brentjens R.J. Engineering strategies to overcome the current roadblocks in CAR T cell therapy. Nat Rev Clin Oncol 2020;17:147–67. DOI: 10.1038/s41571-019-0297-y

4. Liu E., Marin D., Banerjee P. et al. Use of CAR-transduced natural killer cells in CD19-positive lymphoid tumors. N Engl J Med 2020;382:545–53. DOI: 10.1056/NEJMoa1910607

5. Simonetta F., Lohmeyer J.K., Hirai T. et al. Allogeneic CAR invariant natural killer T cells exert potent antitumor effects through host CD8 T-cell cross-priming. Clin Cancer Res 2021;27(21):6054–64. DOI: 10.1158/1078-0432.Ccr-21-1329

6. Huang J., Yang Q., Wang W. et al. CAR products from novel sources: a new avenue for the breakthrough in cancer immunotherapy. Front Immunol 2024;15:1378739. DOI: 10.3389/fimmu.2024.1378739

7. Wolf B.J., Choi J.E., Exley M.A. Novel approaches to exploiting invariant NKT cells in cancer immunotherapy. Front Immunol 2018;9:384. DOI: 10.3389/fimmu.2018.00384

8. Basar R., Daher M., Rezvani K. Next-generation cell therapies: The emerging role of CAR-NK cells. Blood Adv 2020;4(22):5868–76. DOI: 10.1182/bloodadvances.2020002547

9. Berrien-Elliott M.M., Jacobs M.T., Fehniger T.A. Allogeneic natural killer cell therapy. Blood 2023;141(8):856–68. DOI: 10.1182/blood.2022016200

10. Rölle A., Pollmann J., Ewen E. et al. IL-12- producing monocytes and HLA-E control HCMV-driven NKG2C+ NK cell expansion. J Clin Invest 2014;124:5305–16. DOI: 10.1172/JCI77440

11. Granzin M., Wagner J., Köhl U. et al. Shaping of natural killer cell antitumor activity by ex vivo cultivation. Front Immunol 2017;8:458. DOI: 10.3389/fimmu.2017.00458

12. Wrona E., Borowiec M., Potemski P. CAR-NK cells in the treatment of solid tumors. Int. J Mol Sci 2021;22:5899. DOI: 10.3390/ijms22115899

13. Pernold C.P.S., Lagumdzic E., Stadler M. et al. Species comparison: human and minipig PBMC reactivity under the influence of immunomodulating compounds in vitro. Front Immunol 2024;14:1327776. DOI: 10.3389/fimmu.2023.1327776

14. Gulden G., Sert B., Teymur T. et al. CAR-T cells with phytohemagglutinin (PHA) provide anti-cancer capacity with better proliferation, rejuvenated effector memory, and reduced exhausted T cell frequencies. Vaccines (Basel) 2023;11(2):313. DOI: 10.3390/vaccines11020313

15. Yang J., Xie W., Yu K. et al. Methyl butyrate attenuates concanavalin A-induced autoimmune hepatitis by inhibiting Th1-cell activation and homing to the liver. Cell Immunol 2022;378:104575. DOI: 10.1016/j.cellimm.2022.104575

16. Kay J.E. Mechanisms of T lymphocyte activation. Immunol Lett 1991;29(1-2):51–4. DOI: 10.1016/0165-2478(91)90198-j

17. Ustyuzhanina N.E., Bilan M.I., Dmitrenok A.S. et al. Structure and biological activity of a fucosylated chondroitin sulfate from the sea cucumber Cucumaria japonica. Glycobiology 2016;26(5):449–59. DOI: 10.1093/glycob/cwv119

18. Anisimova N., Ustyuzhanina N., Bilan M. et al. Fucoidan and fucosylated chondroitin sulfate stimulate hematopoiesis in cyclophosphamide-induced mice. Mar Drugs 2017;15(10):301. DOI: 10.3390/md15100301

19. Ustyuzhanina N.E., Anisimova N.Y., Bilan M.I. et al. Chondroitin sulfate and fucosylated chondroitin sulfate as stimulators of hematopoiesis. Pharmaceuticals 2021;14(11):1074. DOI: 10.3390/ph14111074

20. Kiselevskiy M.V., Anisimova N.Yu., Ustyuzhanina N.E. et al. Perspectives for the use of fucoidans in clinical oncology. Int J Mol Sci 2022;23(19):11821. DOI: 10.3390/ijms231911821

21. Ustyuzhanina N.E., Bilan M.I., Anisimova N.Yu. et al. Fucosylated chondroitin sulfates with rare disaccharide branches from the sea cucumbers Psolus peronii and Holothuria nobilis: structures and influence on hematopoiesis. Pharmaceuticals (Basel) 2023;16(12):1673. DOI: 10.3390/ph16121673

22. Chikileva I.O., Bruter A.V., Persiyantseva N.A. et al. Anti-cancer potential of transiently transfected HER2-specific human mixed CAR-T and NK cell populations in experimental models; initial studies on fucosylated chondroitin sulfate usage for safer treatment. Biomedicines 2023;11(9):2563. DOI: 10.3390/biomedicines11092563

23. Schmidt D., Ebrahimabadi S., Gomes K.R.S. et al. Engineering CAR-NK cells: how to tune innate killer cells for cancer immunotherapy. Immunother Adv 2022;2(1):ltac003. DOI: 10.1093/immadv/ltac003

24. Ustyuzhanina N.E., Bilan M.I., Anisimova N.Yu. et al. Depolymerization of a fucosylated chondroitin sulfate from the sea cucumber Cucumaria japonica: structure and biological activity of the product. Carbohydr Polym 2022;281:119072. DOI: 10.1016/j.carbpol.2021.119072

25. Ustyuzhanina N.E., Fomitskaya P.A., Gerbst A.G. et al. Synthesis of the oligosaccharides related to branching sites of fucosylated chondroitin sulfates from sea cucumbers. Mar Drugs 2015;13(2):770–87. DOI: 10.3390/md13020770

26. Vinnitskiy D.Z., Ustyuzhanina N.E., Dmitrenok A.S. et al. Synthesis and NMR analysis of model compounds related to fucosylated chondroitin sulfates: GalNAc and Fuc(1→6) GalNAc derivatives. Carbohydr Res 2017;438:9–17. DOI: 10.1016/j.carres.2016.11.015

27. Gambaryan A.S., Tuzikov A.B., Byramova N.E. et al. Human influenza virus recognition of sialo-sugar determinants probed using a panel of sialooligosaccharides. FEBS Lett 1995;366(1):57–60. DOI: 10.1016/0014-5793(95)00488-U