Новый метод выделения чистой фракции интактных клеточных ядер для иммунофлуоресцентного анализа на проточном цитофлуориметре

Введение. Реакция иммунофлуоресценции (РИФ), результаты которой детектируются с помощью проточной цитофлуори-метрии, позволяет идентифицировать клеточные белки, находящиеся либо на поверхности клетки, либо внутри нее в случае использования пермеабилизации. Однако этот метод не дает ответа на вопрос о распределении искомого антигена по клеточным компартментам, в частности о его ассоциации с клеточным ядром. Между тем ядерная локализация изучаемого белка во многом позволяет судить о механизмах его действия. Поэтому разработка протокола выделения интактных клеточных ядер, пригодных для анализа на проточном цитофлуориметре, способна дополнить сведения о расположении и функциональном значении многих ядерноассоциированных протеинов. Цель исследования - разработка метода выделения чистой фракции интактных, стабилизированных клеточных ядер, пригодных для иммунофлуоресцентного анализа на проточном цитофлуориметре. Материалы и методы. В работе изучали ядерную локализацию рецептора фактора роста эндотелия сосудов 1-го типа (VEGF-R1). В качестве объекта исследования использовали линию опухолевых клеток человека A431. Интактность экстрагированных ядер оценивали путем микроскопического исследования окрашенных мазков из ядерной суспензии. Экспрессию рецептора регистрировали с помощью непрямой РИФ на проточном цитофлуориметре. Результаты. Применение разработанного протокола позволило получить суспензию из одиночных неповрежденных клеточных ядер, что является необходимым условием постановки РИФ. На экстрагированных ядрах нам удалось выявить рецептор как на наружной мембране (интактные ядра), так и внутри ядра (пермеабилизованные ядра). Причем внутриядерное содер-жаниерецептора VEGF-R1 превышало таковое на ядерной поверхности в 3,8 раза (17,9 ± 1,04 и 4,8 + 0,26 % соответственно). Заключение. Разработанный нами метод оказался пригодным для идентификации и установления локализации искомых ядерных белков на проточном цитофлуориметре. В сочетании с такими широко применяемыми методиками, как иммуноци-тохимическое исследование, вестерн-блоттинг и др., РИФ на ядрах поможет исследователю сформировать более полное представление о свойствах ядерноассоциированных белков.

экстракция интактных ядер, проточная цитофлуориметрия, рецептор фактора роста эндотелия сосудов 1-го типа, клеточная линия A431, extraction of nuclei, flow cytometry, receptor type 1 for vascular endothelial growth factor, A431 cell line

1. Георгиев Г.П., Мантьева В.Л. Выделение клеточных ядер фенольным методом и их характеристика. Биохимия 1960;25(1):143-50.

2. Mittag F., Leichtle C., Keickbusch I. et al. Cytotoxic effect and tissue penetration of phenol for adjuvant treatment of giant cell tumours. Oncol Lett 2013;5(5):1595-98. doi: 10.3892/ol. 2013.1244. Epub 2013 Mar 11. PMID: 23760940.

3. Hattori M., Tugores A., Veloz L. et al. A simplified method for the preparation of transcriptionally active liver nuclear extracts. DNA Cell Biol 1990; 9(10):777-81. doi: 10.1089/dna. 1990.9.777. PMID: 2264931.

4. Fan F., Wey J.S., McCarty M. F. et al. Expression of vascular endothelial growth factor receptor-1 on human colorectal cancer cells. Oncogen 2005; 24(16):2647-53. doi: 10.1038/sj. onc. 1208246. PMID: 15735759.

5. Lee T.-H., Seng S., Sekine M. et al. Vascular Endothelial Growth Factor Mediates Intracrine Survival in Human Breast Carcinoma Cells through Internally Expressed VEGFR1/FLT1. PLoS Med 2007;4(6):1001 -16. doi:10.1371/journal pmed. 0040186.

6. Tyrsin D. Autoregulation of NFATc1 gene. [Doctorate degree in Natural Sciences]. Wurzburg: Bayerische Julius-Maximilians-Universitat Wurzburg; 2007.

7. Abcam. Product Datasheet for Anti-VEGF Receptor 1 antibody ab2350.

8. Chuvpilo S., Avots A., Berberich-Siebelt F. et al. Multiple NF-ATc isoforms with individual transcriptional properties are synthesized in T lymphocytes. J Immunol 1999;162(12):7294-301. PMID: 10358178.

9. Broers J.L. V., Ramaekers F.C. S. The role of the nuclear lamina in cancer and apoptosis. Adv Exp Med Biol 2014;773: 27-48. doi: 10.1007/978-1-4899-8032-8_2. PMID: 24563342.