Preview

Российский биотерапевтический журнал

Расширенный поиск

Способность клеток беспигментной меланомы кожи человека линии mel Ibr/BRAF+ и ее субклона к росту у иммунодефицитных мышей Balb/с nude при подкожной имплантации

https://doi.org/10.17650/1726-9784-2017-16-2-60-65

Полный текст:

Аннотация

Введение. Лекарственная чувствительность метастатической меланомы кожи (МК) относительно невысока и связана, в том числе, с различной способностью к меланогенезу. Чаще всего (70 % случаев) зависимые от RAF/MEK/ERK сигнального пути терапевтически значимые мутации BRAFобнаруживаются именно в беспигментной МК. В коллекции линий клеток меланомы человека ФГБУ «Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина» Минздрава России имеется культура беспигментной МК линии mel Ibr/BRAF+ и ее различные субклоны, в том числе mel Ibr EE/BRAF+, пригодные для создания моделей in vivo, необходимых для завершающего этапа доклинического изучения перспективных антимеланомных средств. Адаптация исходной линии и ее субклона направлена на получение такой модели. Цель исследования - адаптация клеток беспигментной МК человека линии mel Ibr/BRAF+ и ее субклона mel Ibr EE/BRAF+ к росту у иммунодефицитных мышей Balb/c nude при подкожной (п/к) имплантации. Задачи. Верификация мутации BRAF-V600E в клетках изученных МК; определение числа удвоений клеток для расчета прививочной дозы in vivo; оценка прививаемости клеток мышам Balb/c nude при п/к имплантации; изучение динамики роста измеряемых п/к опухолевых узлов у мышей Balb/c nude. Материалы и методы. Для адаптации использованы стабильно перевиваемая клеточная линия беспигментной МК человека mel Ibr/BRAF+ и клетки субклона mel Ibr EE/BRAF+, прошедшие более 30 пассажей в той же среде со сниженным до 5 % содержанием телячьей эмбриональной сыворотки. Мутацию V600E в экзоне 15 гена BRAFопределяли, выделяя геномную ДНК из 3-суточной клеточной культуры с помощью набора «АмплиПрайм® ДНК-сорб-В» по инструкции производителя (ООО «НекстБио», Россия). Для поиска соматических мутаций в экзоне 15 гена BRAF использовали полимеразную цепную реакцию с соответствующими праймерами. Прививочная доза каждого инокулята была выбрана с учетом числа удвоений клеток, которое определяли по отношению количества выросших клеток к количеству рассеянных клеток 1 пассажа. Прививаемость клеток оценивали пальпаторно под визуальным контролем, а динамику роста измеряемых п/к опухолевых узлов - с помощью морфометрии. Результаты. Показано, что скорость пролиферации клеток исходной линии беспигментной МК человека mel Ibr/BRAF+ в 2раза меньше, чем у ее субклона mel Ibr EE/BRAF+: за 72 ч число удвоений составляет 3 против 6. При имплантации линии mel Ibr/BRAF+ в максимальной для in vivo прививочной дозе 1 х 107 клеток на мышь полная прививаемость не достигнута: опухоль появилась у 1 из 2 мышей. При имплантации субклона mel Ibr ЕЕ/BRAF+ в прививочной дозе 3 х 106 клеток на мышь прививка состоялась у всех 3 мышей, прививаемость составила 100 %. Измеряемые п/к опухолевые узлы изученных МК увеличивались с различной динамикой: в случае mel Ibr/BRAF+ без прогрессивного роста, размер солидного узла составил 120 мм3, а в случае mel Ibr ЕЕ/BRAF+ 1-й пассаж при коротком латентном периоде (5 дней) дал прогрессивно увеличивающиеся до более чем 20-кратного размера опухолевые узлы с устойчивым экспоненциальным ростом. Заключение. Адаптационные характеристики к росту in vivo отсутствуют у МК линии mel Ibr/BRAF+ и ярко выражены у клеток ее субклона mel Ibr ЕЕ/BRAF+, что свидетельствует о его пригодности для получения солидной опухоли у мышей Balb/c nude без предварительного пассирования на мышах. Полученную модель можно рекомендовать для оценки эффективности многократной цитостатической терапии, направленной в том числе и на мутацию BRAF-V600E и стволовые опухолевые клетки.

Об авторах

Н. В. Андронова
ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» Минздрава России
Россия


Л. Ф. Морозова
ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» Минздрава России
Россия


Н. М. Сураева
ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» Минздрава России
Россия


А. А. Лушникова
ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» Минздрава России
Россия


Д. В. Филоненко
ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» Минздрава России
Россия


С. М. Ситдикова
ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» Минздрава России
Россия


И. Н. Михайлова
ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» Минздрава России
Россия


Е. М. Трещалина
ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» Минздрава России
Россия


Список литературы

1. Давыдов М.И., Аксель Е.М. Статистика злокачественных новообразований в России и странах СНГ в 2012 году. М.: Издательская группа РОНЦ, 2014. 226 с.

2. Howlader N., Noone A.M., Krapcho M. et al. SEER Cancer Statistics Review, 1975-2010. Bethesda: National Cancer Institute, 2012. DOI: 10.3322/caac.21262.

3. Демидов Л.В., Утяшев И.А., Харкевич Г.Ю. Подходы к диагностике и терапии меланомы кожи: эра персо нализированной медицины. Consilium medicum (приложение) 2013;2-3:42-7.

4. Chakraborty R., Wieland C.N., Comfere N.I. Molecular targeted therapies in metastatic melanoma. Pharmgenomics Pers Med 2013;6:49-56. DOI: 10.2147/PGPM.S44800. PMID:23843700.

5. Мазуренко Н.Н., Цыганова И.В., Лушникова А.А. и др. Опектр мутаций онкогенов различается в субтипах меланомы кожи. Молекулярная биология 2015;49(6):1022-9.

6. Фицпатрик T., Джонсон P., Вульф K. и др. Дерматология. Атлас-справочник. Пер. с англ. М.: Практика, 1999. С. 385-391.

7. Мазуренко Н.Н. Генетические особенности и маркеры меланомы кожи. Успехи молекулярной биологии 2014;2:26-35.

8. Снарская Е.С., Аветисян К.М., Андрюхина В.В. Беспигментная узловая меланома кожи голени. Российский журнал кожных и венерических болезней. Дерматоонкология 2014;2:4-7.

9. Коллекция клеточных линий меланомы человека. Под ред. И.Н. Михайловой, А.Ю. Барышникова. М.: Издательская группа РОНЦ, 2016. 109 с.

10. Walker G.J., Soyer H.P., Terzian T., Box N.F. Modelling melanoma in mice. Pigment Cell Melanoma Res 2011;24(6):1158-76. DOI: 10.1111/j.1755-148X.2011.00923.x. PMID: 21985222.

11. Андронова Н.В., Морозова Л.Ф., Михайлова И.Н. и др. Моделирование подкожного ксенографта меланомы кожи человека mel Cher с мутацией V600E BRAF на иммунодефицитных мышах для доклинического изучения таргетных противоопухолевых средств. Российский биотерапевтический журнал 2016;15(4):58-64.

12. Михайлова И.Н., Барышников А.Ю., Морозова Л.Ф. и др. Клеточная линия меланомы человека mel Ibr, используемая для получения противоопухолевых вакцин. Патент РФ № 2287576, 2006.

13. Михайлова И.Н., Ковалевский Д.А., Бурова О.С. и др. Экспрессия раково-тестикулярных антигенов в клетках меланомы человека. Cибирский онкологический журнал. Лабораторные и экспериментальные исследования 2010;1(37):29-39.

14. Голубцова Н.В., Степанова Е.В., Бармашов А.Е. и др. Определение специфических противоопухолевых антител у больных диссеминированной меланомой в процессе вакцинотерапии. Российский биотерапевтический журнал 2012;3(11):25-7.

15. Сураева Н.М., Морозова Л.Ф., Самоилов А.В. и др. Изменение морфологических и иммунологических характеристик клеток меланомной линии (mel Ibr) в результате воздействия куриного эмбрионального экстракта. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины 2015;159(4):521-4.

16. Трещалина Е.М. Иммунодефицитные мыши разведения ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН. Возможности использования. М.: Издательская группа РОНЦ, 2010. 16 с.

17. Гаврилов Л.А., Гаврилова Н.С. Поиск механизмов, определяющих продолжительность жизни. Предел клеточных делений - ключ к механизму детерминации продолжительности жизни? В кн.: Биология продолжительности жизни. М.: Наука, 1991. С. 183-194.

18. Трещалина Е.М., Андронова Н.В., Гарин А.М. Доклиническое изучение противоопухолевых препаратов. В кн.: Рациональная фармакотерапия. М.: Литтерра, 2015. С. 75-82.

19. Европейская конвенция по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей, ЕЭС, Страсбург, 1985. Ланималогия 1993;1:29.

20. Большаков О.П. Дидактические и этические аспекты проведения исследований на биомоделях и на лабораторных животных. ВОЗ, 2000. Рекомендации комитетам по этике, проводящим экспертизу биомедицинских исследований. Качественная клиническая практика 2002;9:1-15. PMID: 27296126.


Для цитирования:


Андронова Н.В., Морозова Л.Ф., Сураева Н.М., Лушникова А.А., Филоненко Д.В., Ситдикова С.М., Михайлова И.Н., Трещалина Е.М. Способность клеток беспигментной меланомы кожи человека линии mel Ibr/BRAF+ и ее субклона к росту у иммунодефицитных мышей Balb/с nude при подкожной имплантации. Российский биотерапевтический журнал. 2017;16(2):60-65. https://doi.org/10.17650/1726-9784-2017-16-2-60-65

For citation:


Andronova N.V., Morozova L.F., Suraeva N.M., Lushnikova A.A., Filonenko D.V., Sitdikova S.M., Mihailova I.N., Treshalina H.M. Ability to the growth into immunodeficient Balb/c nude mice after subcutaneous implantation of human amelanotic melanoma skin cell line mel Ibr/BRAF+ and its subclone. Russian Journal of Biotherapy. 2017;16(2):60-65. (In Russ.) https://doi.org/10.17650/1726-9784-2017-16-2-60-65

Просмотров: 38


Creative Commons License
Контент доступен под лицензией Creative Commons Attribution 4.0 License.


ISSN 1726-9784 (Print)
ISSN 1726-9792 (Online)