Способность клеток беспигментной меланомы кожи человека линии mel Ibr/BRAF⁺ и ее субклона к росту у иммунодефицитных мышей Balb/с nude при подкожной имплантации

Введение. Лекарственная чувствительность метастатической меланомы кожи (МК) относительно невысока и связана, в том числе, с различной способностью к меланогенезу. Чаще всего (70 % случаев) зависимые от RAF/MEK/ERK сигнального пути терапевтически значимые мутации BRAFобнаруживаются именно в беспигментной МК. В коллекции линий клеток меланомы человека ФГБУ «Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина» Минздрава России имеется культура беспигментной МК линии mel Ibr/BRAF+ и ее различные субклоны, в том числе mel Ibr EE/BRAF+, пригодные для создания моделей in vivo, необходимых для завершающего этапа доклинического изучения перспективных антимеланомных средств. Адаптация исходной линии и ее субклона направлена на получение такой модели. Цель исследования - адаптация клеток беспигментной МК человека линии mel Ibr/BRAF+ и ее субклона mel Ibr EE/BRAF⁺ к росту у иммунодефицитных мышей Balb/c nude при подкожной (п/к) имплантации. Задачи. Верификация мутации BRAF-V600E в клетках изученных МК; определение числа удвоений клеток для расчета прививочной дозы in vivo; оценка прививаемости клеток мышам Balb/c nude при п/к имплантации; изучение динамики роста измеряемых п/к опухолевых узлов у мышей Balb/c nude. Материалы и методы. Для адаптации использованы стабильно перевиваемая клеточная линия беспигментной МК человека mel Ibr/BRAF⁺ и клетки субклона mel Ibr EE/BRAF⁺, прошедшие более 30 пассажей в той же среде со сниженным до 5 % содержанием телячьей эмбриональной сыворотки. Мутацию V600E в экзоне 15 гена BRAFопределяли, выделяя геномную ДНК из 3-суточной клеточной культуры с помощью набора «АмплиПрайм® ДНК-сорб-В» по инструкции производителя (ООО «НекстБио», Россия). Для поиска соматических мутаций в экзоне 15 гена BRAF использовали полимеразную цепную реакцию с соответствующими праймерами. Прививочная доза каждого инокулята была выбрана с учетом числа удвоений клеток, которое определяли по отношению количества выросших клеток к количеству рассеянных клеток 1 пассажа. Прививаемость клеток оценивали пальпаторно под визуальным контролем, а динамику роста измеряемых п/к опухолевых узлов - с помощью морфометрии. Результаты. Показано, что скорость пролиферации клеток исходной линии беспигментной МК человека mel Ibr/BRAF⁺ в 2раза меньше, чем у ее субклона mel Ibr EE/BRAF⁺: за 72 ч число удвоений составляет 3 против 6. При имплантации линии mel Ibr/BRAF+ в максимальной для in vivo прививочной дозе 1 х 10⁷ клеток на мышь полная прививаемость не достигнута: опухоль появилась у 1 из 2 мышей. При имплантации субклона mel Ibr ЕЕ/BRAF+ в прививочной дозе 3 х 10⁶ клеток на мышь прививка состоялась у всех 3 мышей, прививаемость составила 100 %. Измеряемые п/к опухолевые узлы изученных МК увеличивались с различной динамикой: в случае mel Ibr/BRAF+ без прогрессивного роста, размер солидного узла составил 120 мм³, а в случае mel Ibr ЕЕ/BRAF⁺ 1-й пассаж при коротком латентном периоде (5 дней) дал прогрессивно увеличивающиеся до более чем 20-кратного размера опухолевые узлы с устойчивым экспоненциальным ростом. Заключение. Адаптационные характеристики к росту in vivo отсутствуют у МК линии mel Ibr/BRAF+ и ярко выражены у клеток ее субклона mel Ibr ЕЕ/BRAF⁺, что свидетельствует о его пригодности для получения солидной опухоли у мышей Balb/c nude без предварительного пассирования на мышах. Полученную модель можно рекомендовать для оценки эффективности многократной цитостатической терапии, направленной в том числе и на мутацию BRAF-V600E и стволовые опухолевые клетки.

беспигментная меланома человека, линия клеток mel Ibr/BRAF⁺, субклон mel Ibr ЕЕ/BRAF⁺, прививаемость, динамика роста опухоли, human amelanotic melanoma of skin, cell cultures, mel Ibr/BRAF⁺, subclone mel Ibr EE/BRAF⁺, transplanted ability, tumor growth dynamics

1. Давыдов М.И., Аксель Е.М. Статистика злокачественных новообразований в России и странах СНГ в 2012 году. М.: Издательская группа РОНЦ, 2014. 226 с.

2. Howlader N., Noone A.M., Krapcho M. et al. SEER Cancer Statistics Review, 1975-2010. Bethesda: National Cancer Institute, 2012. DOI: 10.3322/caac.21262.

3. Демидов Л.В., Утяшев И.А., Харкевич Г.Ю. Подходы к диагностике и терапии меланомы кожи: эра персо нализированной медицины. Consilium medicum (приложение) 2013;2-3:42-7.

4. Chakraborty R., Wieland C.N., Comfere N.I. Molecular targeted therapies in metastatic melanoma. Pharmgenomics Pers Med 2013;6:49-56. DOI: 10.2147/PGPM.S44800. PMID:23843700.

5. Мазуренко Н.Н., Цыганова И.В., Лушникова А.А. и др. Опектр мутаций онкогенов различается в субтипах меланомы кожи. Молекулярная биология 2015;49(6):1022-9.

6. Фицпатрик T., Джонсон P., Вульф K. и др. Дерматология. Атлас-справочник. Пер. с англ. М.: Практика, 1999. С. 385-391.

7. Мазуренко Н.Н. Генетические особенности и маркеры меланомы кожи. Успехи молекулярной биологии 2014;2:26-35.

8. Снарская Е.С., Аветисян К.М., Андрюхина В.В. Беспигментная узловая меланома кожи голени. Российский журнал кожных и венерических болезней. Дерматоонкология 2014;2:4-7.

9. Коллекция клеточных линий меланомы человека. Под ред. И.Н. Михайловой, А.Ю. Барышникова. М.: Издательская группа РОНЦ, 2016. 109 с.

10. Walker G.J., Soyer H.P., Terzian T., Box N.F. Modelling melanoma in mice. Pigment Cell Melanoma Res 2011;24(6):1158-76. DOI: 10.1111/j.1755-148X.2011.00923.x. PMID: 21985222.

11. Андронова Н.В., Морозова Л.Ф., Михайлова И.Н. и др. Моделирование подкожного ксенографта меланомы кожи человека mel Cher с мутацией V600E BRAF на иммунодефицитных мышах для доклинического изучения таргетных противоопухолевых средств. Российский биотерапевтический журнал 2016;15(4):58-64.

12. Михайлова И.Н., Барышников А.Ю., Морозова Л.Ф. и др. Клеточная линия меланомы человека mel Ibr, используемая для получения противоопухолевых вакцин. Патент РФ № 2287576, 2006.

13. Михайлова И.Н., Ковалевский Д.А., Бурова О.С. и др. Экспрессия раково-тестикулярных антигенов в клетках меланомы человека. Cибирский онкологический журнал. Лабораторные и экспериментальные исследования 2010;1(37):29-39.

14. Голубцова Н.В., Степанова Е.В., Бармашов А.Е. и др. Определение специфических противоопухолевых антител у больных диссеминированной меланомой в процессе вакцинотерапии. Российский биотерапевтический журнал 2012;3(11):25-7.

15. Сураева Н.М., Морозова Л.Ф., Самоилов А.В. и др. Изменение морфологических и иммунологических характеристик клеток меланомной линии (mel Ibr) в результате воздействия куриного эмбрионального экстракта. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины 2015;159(4):521-4.

16. Трещалина Е.М. Иммунодефицитные мыши разведения ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН. Возможности использования. М.: Издательская группа РОНЦ, 2010. 16 с.

17. Гаврилов Л.А., Гаврилова Н.С. Поиск механизмов, определяющих продолжительность жизни. Предел клеточных делений - ключ к механизму детерминации продолжительности жизни? В кн.: Биология продолжительности жизни. М.: Наука, 1991. С. 183-194.

18. Трещалина Е.М., Андронова Н.В., Гарин А.М. Доклиническое изучение противоопухолевых препаратов. В кн.: Рациональная фармакотерапия. М.: Литтерра, 2015. С. 75-82.

19. Европейская конвенция по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей, ЕЭС, Страсбург, 1985. Ланималогия 1993;1:29.

20. Большаков О.П. Дидактические и этические аспекты проведения исследований на биомоделях и на лабораторных животных. ВОЗ, 2000. Рекомендации комитетам по этике, проводящим экспертизу биомедицинских исследований. Качественная клиническая практика 2002;9:1-15. PMID: 27296126.