Ability to the growth into immunodeficient Balb/c nude mice after subcutaneous implantation of human amelanotic melanoma skin cell line mel Ibr/BRAF+ and its subclone

Introduction. Drug sensitivity of metastatic .skin melanoma (SM) is rather low and bound, including, with various ability to a melanogenesis. Most often (70 %) dependent on RAF/MEK/ERK of an signal pathway therapeutic significant BRAF of a mutation are found in the amelanotic SM. In the N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center, Ministry of Health of Russia œllection of human melanoma cell lines is a culture of amelanotic SM mel Ibr/BRAF⁺ and its various subclones, including, subclone mel Ibr EE/BRAF⁺ suitable for creation of the models in vivo that are necessary for the final stage of preclinical studying perspective antimelanomа agents. Adaptation to the in vivo growth of these cell cultures is directed to receiving such model. Objective. Adaptation of the cell cultures of these SM to the growth at immunodeficient Balb/c nude mice by the subcutaneous implantation. There were a few positions: BRAF-V600E mutation verification in the cells; definition of number of cell doublings for calculation of an implanted dose for in vivo; implantation ability of SM cells into the Balb/c nude mice by s. c. inoculation; investigation of growth dynamics of measured s. c. tumor nodules in Balb/c nude mice. Materials and methods. For adaptation are used stable transplanted human SM cell of mel Ibr/BRAF+ and the its subclone of mel Ibr EE/BRAF+ which passed more than 30 passages in the same environment with the reduced content up to 5 % of fetal serum veal. V600E mutation in an exon of the 15 gene of BRAF was defined in SM cells, emitting genomic DNA from 3-day cell culture by means of the «AmplyPrime® DNA-sorb-V» set according to the instruction of the producer (NexBio Ltd., Russia). For searching of somatic mutations in an exon of the 15 gene of BRAF used polymerase chain reaction with the corresponding primers. Calculation of a implanted cell dose of each of SM cells is defined according to number of doubling cells, determined at cultivation by the relation of number of the dispelled cells which grew to quantity at a passage. The transplantable ability of the cells was controlled by hands and vision observation, the characteristics of the growth of subcutaneous tumor nodules with calculating of its dynamics was controlled by a morphometry. Results. It was shown, that proliferation level of mel Ibr/BRAF+ was a twice less than at its subclone mel Ibr EE/BRAF⁺: in 72 h the number of doubling makes 3 against 6. At implantation of the mel Ibr/BRAF⁺ in the maximal for in vivo inoculated dose of 1 x 10⁷ cells on mouse the complete transplantable ability was not reached, the tumor left at 1 of 2 mice. At implantation of a subclone of mel Ibr EE/BRAF⁺ in a vaccinating dose 3 x 10⁶ cells on a mouse the inoculation took place at all 3 mice, 100 % transplantable ability was achieved. Measured s. c. tumor nodules of the studied melanomas grew with various dynamics, in case of mel Ibr/BRAF⁺ without malignant progressive, during of 3 weeks after tumor inoculation a volume of solid tumor nodule was only 120 mm³. In case of subclone mel Ibr EE/BRAF⁺ of 1^st passage at the short latent period (5 days) gave the tumor nodules which are progressively increasing to more 20-fold size with steady exponential study. Conclusion. Adaptation characteristics to the in vivo growth are absent at the mel Ibr/BRAF⁺ line and are brightly expressed for cells of a subclone of mel Ibr EE/BRAF⁺ that testifies to its suitability for receiving a solid tumor at Balb/c nude mice without preliminary browning on mice. The received model can be recommended for assessment of effectiveness of multiple cytostatic therapy, including for BRAF-V600E mutation.

беспигментная меланома человека, линия клеток mel Ibr/BRAF⁺, субклон mel Ibr ЕЕ/BRAF⁺, прививаемость, динамика роста опухоли, human amelanotic melanoma of skin, cell cultures, mel Ibr/BRAF⁺, subclone mel Ibr EE/BRAF⁺, transplanted ability, tumor growth dynamics

1. Давыдов М.И., Аксель Е.М. Статистика злокачественных новообразований в России и странах СНГ в 2012 году. М.: Издательская группа РОНЦ, 2014. 226 с.

2. Howlader N., Noone A.M., Krapcho M. et al. SEER Cancer Statistics Review, 1975-2010. Bethesda: National Cancer Institute, 2012. DOI: 10.3322/caac.21262.

3. Демидов Л.В., Утяшев И.А., Харкевич Г.Ю. Подходы к диагностике и терапии меланомы кожи: эра персо нализированной медицины. Consilium medicum (приложение) 2013;2-3:42-7.

4. Chakraborty R., Wieland C.N., Comfere N.I. Molecular targeted therapies in metastatic melanoma. Pharmgenomics Pers Med 2013;6:49-56. DOI: 10.2147/PGPM.S44800. PMID:23843700.

5. Мазуренко Н.Н., Цыганова И.В., Лушникова А.А. и др. Опектр мутаций онкогенов различается в субтипах меланомы кожи. Молекулярная биология 2015;49(6):1022-9.

6. Фицпатрик T., Джонсон P., Вульф K. и др. Дерматология. Атлас-справочник. Пер. с англ. М.: Практика, 1999. С. 385-391.

7. Мазуренко Н.Н. Генетические особенности и маркеры меланомы кожи. Успехи молекулярной биологии 2014;2:26-35.

8. Снарская Е.С., Аветисян К.М., Андрюхина В.В. Беспигментная узловая меланома кожи голени. Российский журнал кожных и венерических болезней. Дерматоонкология 2014;2:4-7.

9. Коллекция клеточных линий меланомы человека. Под ред. И.Н. Михайловой, А.Ю. Барышникова. М.: Издательская группа РОНЦ, 2016. 109 с.

10. Walker G.J., Soyer H.P., Terzian T., Box N.F. Modelling melanoma in mice. Pigment Cell Melanoma Res 2011;24(6):1158-76. DOI: 10.1111/j.1755-148X.2011.00923.x. PMID: 21985222.

11. Андронова Н.В., Морозова Л.Ф., Михайлова И.Н. и др. Моделирование подкожного ксенографта меланомы кожи человека mel Cher с мутацией V600E BRAF на иммунодефицитных мышах для доклинического изучения таргетных противоопухолевых средств. Российский биотерапевтический журнал 2016;15(4):58-64.

12. Михайлова И.Н., Барышников А.Ю., Морозова Л.Ф. и др. Клеточная линия меланомы человека mel Ibr, используемая для получения противоопухолевых вакцин. Патент РФ № 2287576, 2006.

13. Михайлова И.Н., Ковалевский Д.А., Бурова О.С. и др. Экспрессия раково-тестикулярных антигенов в клетках меланомы человека. Cибирский онкологический журнал. Лабораторные и экспериментальные исследования 2010;1(37):29-39.

14. Голубцова Н.В., Степанова Е.В., Бармашов А.Е. и др. Определение специфических противоопухолевых антител у больных диссеминированной меланомой в процессе вакцинотерапии. Российский биотерапевтический журнал 2012;3(11):25-7.

15. Сураева Н.М., Морозова Л.Ф., Самоилов А.В. и др. Изменение морфологических и иммунологических характеристик клеток меланомной линии (mel Ibr) в результате воздействия куриного эмбрионального экстракта. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины 2015;159(4):521-4.

16. Трещалина Е.М. Иммунодефицитные мыши разведения ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН. Возможности использования. М.: Издательская группа РОНЦ, 2010. 16 с.

17. Гаврилов Л.А., Гаврилова Н.С. Поиск механизмов, определяющих продолжительность жизни. Предел клеточных делений - ключ к механизму детерминации продолжительности жизни? В кн.: Биология продолжительности жизни. М.: Наука, 1991. С. 183-194.

18. Трещалина Е.М., Андронова Н.В., Гарин А.М. Доклиническое изучение противоопухолевых препаратов. В кн.: Рациональная фармакотерапия. М.: Литтерра, 2015. С. 75-82.

19. Европейская конвенция по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей, ЕЭС, Страсбург, 1985. Ланималогия 1993;1:29.

20. Большаков О.П. Дидактические и этические аспекты проведения исследований на биомоделях и на лабораторных животных. ВОЗ, 2000. Рекомендации комитетам по этике, проводящим экспертизу биомедицинских исследований. Качественная клиническая практика 2002;9:1-15. PMID: 27296126.