Mодификация красного флуоресцентного белка TagRFP для уменьшения его иммуногенности при создании флуоресцирующих модельных опухолей иммунокомпетентных мышей Balb / C

Введение. Длинноволновые флуоресцентные белки наиболее перспективны при исследованиях in vivo на флуоресцирующих моделях опухолей лабораторных животных. Если экспрессирующие флуоресцентные белки опухоли имеют большую иммуногенность для данной линии иммунокомпетентных мышей по сравнению с исходными, то сложно вычленить иммунную составляющую противоопухолевого действия цитотоксической терапии.

Цель исследования – получение мышиных опухолевых клеточных линий 4T1, стабильно экспрессирующих исходный красный флуоресцентный белок TagRFP и мутантный белок TagRFP-L228A, получение опухолевых моделей на их основе и оценка гуморального иммунного ответа мышей линии Balb / c на такие опухоли.

Материалы и методы. Эукариотические плазмиды pcDNA3, содержащие гены, кодирующие экспрессию исходного белка TagRFP (TagRFP-WT) и белка с мутацией L228A (TagRFP-L228A), получали из прокариотических плазмид генно-инженерными методами. Индивидуальные клоны опухолевых клеток 4T1, экспрессирующие TagRFP-WT и TagRFP-L228A, получали путем последовательной липосомальной трансфекции клеток эукариотическими плазмидами, селекции и клонирования. Опухолевые модели получали подкожной инокуляцией суспензии клеток 4T1, 4T1-TagRFP-WT и 4T1-TagRFP-L228A самкам мышей Balb / c. Через 4 нед оценивали иммунный ответ на белок TagRFP методом иммуноферментного анализа по связыванию сывороток венозной крови мышей с исходным белком TagRFP-WT.

Результаты. Получены плазмиды для экспрессии белков TagRFP-WT и TagRFP-L228A в эукариотических клетках и клоны клеток 4T1, стабильно экспрессирующие эти белки. После инокуляции клеток 4T1-TagRFP-WT, 4T1-TagRFP-L228A и 4T1 опухоли развились у всех мышей соответствующих групп. Методом иммуноферментного анализа на планшетах с адсорбированным белком TagRFP-WT показано наличие у мышей Balb / c с флуоресцирующими опухолями гуморального иммунного ответа на исходный флуоресцентный белок в отличие от такового у мышей с опухолями 4T1. По сравнению с сыворотками мышей с опухолью 4T1-TagRFP-WT связывание с исходным белком TagRFP-WT сывороток мышей с опухолями 4T1-TagRFP-L228A уменьшается более чем в 4 раза.

Заключение. Единственная аминокислотная замена L228A в белке TagRFP приводит к существенному уменьшению гуморального иммунного ответа на экспрессируемый опухолями белок TagRFP-L228A по сравнению с исходным TagRFP-WT. Это позволит использовать экспрессирующие TagRFP-L228A клеточные линии для создания оптимизированных опухолевых моделей для мышей Balb / c.

1. Shcherbo D., Murphy C.S., Ermakova G.V. et al. Far-red fluorescent tags for protein imaging in living tissues. Biochem J 2009;418(3):567–74. DOI: 10.1042/BJ20081949

2. Savitsky A.P., Meerovich I.G., Zherdeva V.V. et al. Threedimensional in vivo imaging of tumors expressing red fluorescent proteins. In: In Vivo Cellular Imaging Using Fluorescent Proteins; Robert M. Hoffman (ed.)., Springer Science+Business Media New York 2012, 872. DOI: 10.1007/978-1-61779-797-2_7

3. Mishchenko T.A., Balalaeva I.V., Klimenko M.O. et al. Far-red fluorescent murine glioma model for accurate assessment of brain tumor progression. Cancers (Basel) 2022;14(15):3822. DOI: 10.3390/cancers14153822

4. Kubota Y., Aoki Y., Wang A. et al. Non-invasive fluorescence imaging of breast cancer metastasis to the brain in an orthotopic nude-mouse model with very-narrow-band-width laser excitation of red fluorescent protein resulting in an ultra-bright signal without skin autofluorescence. In Vivo 2024;38(1):69–72. DOI: 10.21873/invivo.13411

5. Zherdeva V.V., Kazachkina N.I., Shcheslavskiy V., Savitsky A.P. Long-term fluorescence lifetime imaging of a genetically encoded sensor for caspase-3 activity in mouse tumor xenografts. J Biomed Opt 2018;23(3):1–11. DOI: 10.1117/1.JBO.23.3.03500

6. Galluzzi L., Guilbaud E., Schmidt D. et al. Targeting immunogenic cell stress and death for cancer therapy. Nat Rev Drug Discov 2024;23(6):445–60. DOI: 10/1038/s41573-024-00920-9

7. Tan L., Shen X., He Zh., Lu Y. The role of photodynamic therapy in triggering cell death and facilitating antitumor immunology. Front Oncol 2022;12:863107. DOI: 10.3389/fonc.2022.863107

8. Alzeibak R., Mishchenko T.A., Shilyagina N.Y. et al. Targeting immunogenic cancer cell death by photodynamic therapy: past, present and future. J Immunother Cancer 2021;9(1):e001926. DOI: 10.1136/jitc-2020-001926

9. Chou W., Sun T., Peng N. et al. Photodynamic therapy-induced anti-tumor immunity: influence factors and synergistic enhancement strategies. Pharmaceutics 2023;15(1):2617. DOI: 10.3390/pharmaceutics15112617

10. Hoffman R.M. Fluorescent proteins as visible in vivo sensors. Prog Mol Biol Transl Sci 2013;113:389–402. DOI: 10.1016/B978-0-12-386932-6.00010-7

11. Steinbauer M., Guba M., Cernaianu G. et al. GFP-transfected tumor cells are useful in examining early metastasis in vivo, but immune reaction precludes long-term tumor development studies in immunocompetent mice. Clin Exp Metastasis 2003;20(2): 135–41. DOI: 10.1023/a:1022618909921

12. Vodopyanov S.S., Kunin M.A., Garanina A.S. et al. Preparation and testing of cells expressing fluorescent proteins for intravital imaging of tumor microenvironment. Bull Exp Biol Med 2019;167(1):123–30. DOI: 10.1007/s10517-019-04475-312

13. Huang L., Bommireddy R., Munoz L.E. et al. Expression of tdTomato and luciferase in a murine lung cancer alters the growth and immune microenvironment of the tumor. PLoS One 2021;16(8):e0254125. DOI: 10.1371/journal.pone.0254125

14. Castano A.P., Liu Q., Hamblin M.R. A green fluorescent protein-expressing murine tumour but not its wild-type counterpart is cured by photodynamic therapy. Br J Cancer 2006;94(3):391–7. DOI: 10.1023/A:10226189099218

15. Skelton D., Satake N., Kohn D.B. The enhanced green fluorescent protein (eGFP) is minimally immunogenic in C57BL/6 mice. Gene Ther 2001;8(23):1813–4. DOI: 10.1038/sj.gt.3301586

16. Eyes T.J. Deimmunisation of enhanced green fluorescent protein. PhD Thesis. The University of Manchester (United Kingdom), 2014.

17. NetMHC-4.0. URL: https://services.healthtech.dtu.dk/services/NetMHC-4.0/.

18. ElliPro. URL: http://tools.iedb.org/ellipro.

19. DiscoTope-3.0 Structure Base Antibody Prediction. URL: https://services.healthtech.dtu.dk/services/DiscoTope-3.0.

20. Меерович И.Г., Марынич Н.К., Гавшина А.В., Савицкий А.П. Мутанты красного флуоресцентного белка TagRFP с пониженной иммуногенностью для использования во флуоресцирующих опухолевых моделях. В кн.: VI Международная конференция «Постгеном’2024», XI Российский симпозиум «Белки и пептиды», Российско-китайский конгресс в области наук о жизни. Сборник тезисов докладов. М.: Перо, 2024.

21. Freshney R.I. Culture of animal cells: a manual of basic technique and specialized applications. 6th ed. Hoboken, N.J.: Wiley-Blackwell, 2010. P. 208–11. DOI: 10.1002/9780470649367