ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
В обзоре литературы рассмотрены результаты исследований различных ингибиторов тубулина (основного компонента микротрубочек), преимущественно колхициноподобных соединений – комбретастатинов А-4 и А-1 (СА-4 и СА-1). Представлены данные исследований SAR (structure activity relation), механизмов действия, оцененных в системах in vitro (на культурах опухолевых клеток) и in vivo (у животных с привитыми опухолями мышей и ксенографтами опухолей человека различного гистогенеза), охарактеризовано фосфатное производное комбретастатина А-4 как vascular disrupting agent (VDAs), описаны подходы к получению аналогов СА-4, стабильных в cis-конфигурации, и способы повышения гидрофильности перспективных производных при сохранении их высокой цитотоксичности. Приведены данные о результатах клинических испытаний СА-4Р и СА-1Р, назначаемых индивидуально или в комбинации с химиопрепаратами. На основании анализа имеющихся результатов исследований производных комбретастатинов А-4 и А-1 сделан вывод об отсутствии среди них в настоящее время идеального водорастворимого вещества со стабильной cis-конфигурацией молекулы и высокой цитотоксической активностью, на основе которого можно создать активное противоопухолевое лекарственное средство. Целью обзора является систематизация данных о противоопухолевой активности, путях модификации и возможностях терапевтического использования соединений на основе комбретастатинов (СА-4 и СА-1) и их производных.
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
Введение. Циркулирующая в плазме крови опухолевая ДНК (цоДНК) является потенциальным маркером для мониторинга опухолевого процесса. Однако возможность использования мышиной сингенной подкожной модели меланомы для оценки уровня цоДНК остается неясной.
Цель исследования – оценка уровня детектируемой цоДНК в мышиной сингенной модели меланомы B16-F10 методом цифровой капельной полимеразной цепной реакции (цкПЦР).
Материалы и методы. Для количественного определения цоДНК из клеток B16-F10 в плазме крови был разработан и валидирован метод цкПЦР. Для получения экспериментальных опухолей мышам линии С57Bl6 подкожно вводили суспензию клеток линии мышиной меланомы B16-F10. Через день, на 7-, 14- и 21-й дни после перевивки опухоли у мышей отбирали кровь из ретроорбитального синуса. Из плазмы крови выделяли циркулирующую ДНК. На 21-й день после перевивки опухоли животных выводили из эксперимента.
Результаты. Разработан и валидирован метод цкПЦР для детекции цоДНК в сингенной модели меланомы B16-F10 у мышей линии С57Bl6. Аналитический сигнал линеен в диапазоне 0,5–32 копии/мкл, значение R2 составило 0,997. Эмпирический предел обнаружения цоДНК составил 1 копию/мкл в присутствии 5 нг геномной ДНК нормальной ткани. Значения коэффициента вариации состояли в диапазоне от 44,5 % (для 1 копии/мкл) до 16,6 % (16 копий/мкл). Циркулирующая опухолевая ДНК в сингенной модели меланомы B16-F10 у мышей линии С57Bl6 достоверно детектируется на 21-й день после перевивки опухолевых клеток (p = 0,004). Уровень цоДНК коррелирует с объемом опухоли (ρ = 0,95, p = 0,05) и уровнем циркулирующей ДНК (ρ = 1, p = 0,0).
Заключение. Мышиная сингенная подкожная модель меланомы B16-F10 может использоваться для мониторинга уровня цоДНК при исследовании новых подходов для лечения меланомы.
Введение. В неклинических исследованиях противоопухолевых средств использование различных источников получения опухолевого материала и мест трансплантации существенно влияет на параметры роста сингенных опухолей, на их инвазивный потенциал и профиль метастазирования.
Цель исследования – оценить кинетику роста сингенной меланомы B16 у мышей C57BL/6 при ортотопической (внутрикожной) и интрамаммарной (в жировую клетчатку молочной железы) трансплантации опухолевого материала, полученного разными методами.
Материалы и методы. Эксперимент проведен на половозрелых мышах-самках линии C57BL/6. Сформировано 6 групп по 8 животных в каждой. Группам 1–3 трансплантировали опухолевый материал меланомы В16 в виде изографтов (50 % суспензия клеток из фрагмента опухоли), группам 4–6 – опухолевые клетки из первичной культуры, культивированные in vitro до раннего (P6) и позднего (P14) пассажей. Перевивку осуществляли внутрикожно или интрамаммарно.
Результаты. Установлено, что метод получения опухолевого материала (изографт или клеточная линия), число пассажей in vitro и сайт трансплантации (внутрикожно или интрамаммарно) значимо влияют на фенотипические особенности меланомы B16 после перевивки животным. В результате клональной селекции in vitro и in vivo наблюдали существенные различия во времени появления измеряемых опухолей, кинетике роста и профиле метастазирования. Интрамаммарная трансплантация опухолей обеспечивала снижение частоты возникновения язв (некрозов опухоли) по сравнению с внутрикожной перевивкой вне зависимости от источника опухолевого материала. В то же время развитие изъязвления опухолей значимо не влияло на продолжительность жизни животных.
Заключение. Результаты проведенного исследования дополняют имеющиеся сведения о том, что клетки сингенной меланомы B16 обладают как наследственными, так и селекционными фенотипическими признаками, которые влияют на их способность к метастазированию. Полученные данные могут быть использованы в рутинной работе центров доклинических исследований при планировании и проведении экспериментальных работ с использованием сингенных моделей опухолей.
Введение. Известно, что инактивирующие мутации в генах Chek2 и Gprc5a ассоциированы с развитием онкологических заболеваний. Экспериментальные исследования канцерогенеза у генетически модифицированных мышей позволяют получить новые данные об их влиянии на развитие патологии.
Цель исследования – на мышах с гетерозиготными инактивирующими мутациями в генах Chek2 и Gprc5a оценить выживаемость, а также множественность и размеры экспериментальных опухолей в модели канцерогенеза легкого.
Материалы и методы. Использовали мышей гибридов 2-го поколения от скрещивания гетерозиготных по исследуемым мутациям самцов CBAB6F1 с самками BALB / c дикого типа: потомков носителей мутаций Chek2dAA (76 самцов и 64 самки) и Gprc5ainsA (60 самцов и 42 самки). Начиная с 4-месячного возраста мыши получали уретан (этилкарбамат) внутрибрюшинно в дозе 600 мг / кг еженедельно в течение 6 нед. После генотипирования с помощью аллель-специфической полимеразной цепной реакции животных распределяли по группам. Через 40 нед от начала опыта проводили оценку параметров канцерогенеза.
Результаты. Доля доживших до 3-месячного возраста мышей с мутациями примерно соответствовала менделевскому распределению (35 / 41 самцы и 33 / 31 самки) для потомства самцов, гетерозиготных по Chek2dAA и была существенно меньше в случае Gprc5ainsA (20 / 40 самцы и 17 / 25 самки; p = 0,043). Гибель носителей Gprc5ainsA в течение опыта также была выше, чем у контрольной группы (p = 0,0506 у самок). У 2 из 4 погибших до окончания опыта самок Gprc5ainsA обнаружены синхронные новообразования легких и тимуса, не встречавшиеся в других группах. В конце эксперимента не выявлено существенных различий между значениями показателей множественности, средних линейных размеров и объемов опухолей в группах мышей с мутациями и без них.
Заключение. Установлено, что гетерозиготная инактивирующая мутация Chek2dAA у мышей не влияет на развитие животных раннего возраста и не модифицирует параметры индуцированного канцерогенеза легкого. Гетерозиготное носительство мутации Gprc5ainsA у мышей повышает риск ранней гибели и чувствительность к токсическому и канцерогенному воздействию уретана.
Введение. У больных HER2-положительным раком молочной железы (HER2+ РМЖ) в результате таргетной анти-HER2-терапии значительно удлиняется период ремиссии. Однако часто развивается резистентность к терапии. В поисках эффективных дополнительных препаратов при комбинированной терапии целесообразно изучить противоопухолевое действие ломустина (CCNU) при HER2+ РМЖ. Ломустин не является таргетным препаратом, но используются для лечения метастазов в головной мозг, поскольку известен как одно из стандартных средств для терапии глиобластом.
Цель исследования – оценить ингибирующую активность ломустина на рост спонтанного HER2+ РМЖ у самок мышей FVB/N.
Материалы и методы. Использовали трансгенных мышей HER2+ линии FVB/N – самок в возрасте 5–6 мес, из которых отобрали 7 пар животных (для контроля и лечения ломустином) с одинаковыми по размеру спонтанными опухолями молочных желез в каждой паре. Ломустин вводили однократно в дозе 50 мг/кг (перорально через зонд) с последующим 30-дневным наблюдением. Критериями оценки противоопухолевого эффекта были ТРО % (торможение роста опухолей), а также ИРО (индекс роста опухоли), рассчитываемый по отношению площади (S) под кинетической кривой роста опухолей в группе животных с лечением ломустином (SЭ ) к контролю (SК ). При таком сравнении в контроле ИРО всегда будет 100 %.
Результаты. За период наблюдения объем опухолей молочной железы в контроле (введение растворителя) увеличился в 8 раз, тогда как у мышей, получавших ломустин, опухоли значительно регрессировали. ТРО после лечения ломустином составило 78–92 % (р = 0,007–0,0006 к контролю). Суммарное среднее значение S достоверно различалось в 5,6 раза при сравнении двух групп, а ИРО у мышей в группе ломустина составил 18,8 %, тогда как в контроле 100 %; р = 0,0006).
Заключение. Ломустин проявляет выраженный ингибирующий эффект на рост спонтанного HER2+ РМЖ у трансгенных мышей FVB/N. Результаты свидетельствуют о целесообразности применения ломустина у больных с HER2+ РМЖ, осложненным церебральными метастазами.
Введение. Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae, пневмококк) – условно-патогенные бактерии, вызывающие воспалительные заболевания у человека. Одним из факторов вирулентности S. pneumoniae является пневмолизин (Ply) – холестеролзависимый гемолитический токсин, который при взаимодействии с холестерином клеточных мембран эукариотов формирует поры и приводит к разрушению и гибели клеток.
Цель исследования – иммунохимическая характеристика Ply и оценка его цитотоксического действия в культуре клеток яичника китайского хомячка CHO-K1.
Материалы и методы. Для получения Ply штамм S. pneumoniae серотипа 3 культивировали в сердечно-мозговом бульоне, осаждали бактериальные клетки центрифугированием и подвергали ультразвуковой дезинтеграции. Наличие Ply в полученном препарате подтверждали с помощью иммуноблоттинга с моноклональными антителами к рекомбинантному Ply. Цитопатогенное действие Ply исследовали на культуре пролинзависимых эпителиоподобных клеток яичника китайского хомячка CHO-К1 в среде RPMI-1640. Гемолитическую активность Ply оценивали в реакции с эритроцитами мыши.
Результаты. Методом ультразвуковой дезинтеграции клеток штамма S. pneumoniae серотипа 3 с последующим осаждением сульфатом аммония получен белок, образующий на электрофорезе полосу, соответствующую молекулярной массе Ply (53 кДа). Полученный белок обладал способностью лизировать эритроциты мыши. Подлинность Ply подтверждена в иммуноблоттинге с моноклональными антителами к рекомбинантному Ply. Ply оказывал цитопатогенное действие на клетки яичника китайского хомячка CHO-K1. Минимальная доза препарата, индуцирующая токсическое действие на клетки, проявляющаяся в появлении наряду с нормальными клетками округлых и мелких клеток, составляла 16,4 мкг/мл по белку. При увеличении концентрации до 65,6 мкг/мл обнаруживали только мелкие круглые клетки. Дальнейшее увеличение концентрации приводило к полной деструкции клеток CHO-K1.
Заключение. Пневмолизин можно использовать для разработки новых лекарственных средств, предназначенных для терапии пневмококковых инфекций.
Введение. ГМЛ-3 обладает одновременно анксиолитическим и антидепрессивным эффектом. Однако, как и примерно 70 % разрабатываемых в качестве активных фармацевтических субстанций (АФС), ГМЛ-3 практически нерастворим в воде, что может негативно сказываться на его биодоступности. Создание твердых дисперсий (ТД) путем кристаллизации с эвтектикой или переводом АФС в аморфное состояние является одним из перспективных методов, позволяющих добиться высокой растворимости и скорости растворения АФС.
Цель исследования – изучение кристалличности и стабильности аморфных твердых дисперсий ГМЛ-3 с поливинилпирролидоном (ПВП), а также высвобождения ГМЛ-3 из ТД в тесте «Растворение». В качестве объектов исследования выступали АФС ГМЛ-3, ПВП и ТД ГМЛ-3.
Материалы и методы. ТД создавали методом удаления растворителя с использованием этанола (ГМЛ-3 растворим в этаноле при соотношении 1:7) и ПВП с молекулярной массой 24–27 кДа. Кристалличность и стабильность АФС ГМЛ-3 в ТД исследовали методами дифференциально-сканирующей калориметрии и рентгенофазового анализа. Уровень высвобождения АФС ГМЛ-3 из ТД оценивали спектрофотометрически при λ = 256 нм.
Результаты. В ТД (1:5, 1:10) происходило образование очагов кристаллизации, ведущих к повторной кристаллизации АФС ГМЛ-3 во время процесса отгонки растворителя (для концентрации 1:5) или быстрой потери гомогенности ввиду образования зон повышенного содержания полимера и АФС (для концентрации 1:10). В соотношениях 1:15,20 ТД обладали высокой стабильностью (после выдерживания в течение 146,5 ч при 55 °С) и высоким уровнем высвобождения АФС ГМЛ-3 в среду воды очищенной (96 %).
Заключение. Стабильные аморфные ТД ГМЛ-3 при соотношениях АФС: полимер = 1:15,20 обеспечивают высокий уровень высвобождения ГМЛ-3 в среду воды очищенной, что позволяет сделать вывод о перспективности использования ТД ГМЛ-3 при разработке лекарственных форм (таблеток и капсул).
Введение. Одним из наиболее важных критериев качества таблеток является испытание для подтверждения высвобождения действующего вещества – тест «Растворение». Значимость данного теста определяется тем, что от высвобождения из лекарственной формы зависят скорость и степень всасывания лекарственного средства in vivo. Особенную сложность представляет разработка теста «Растворение» для веществ, которые плохо растворимы в воде.
Цель исследования – разработка методики теста «Растворение» для таблеток цифетрилина 60 мг и изучение высвобождения цифетрилина из таблеток.
Материалы и методы. В работе использовали оригинальный аналог соматостатина – цифетрилин, синтезированный в лаборатории химического синтеза ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России. Разработку теста проводили для таблеток цифетрилина 60 мг. Исследование проводили на тестере для проверки растворения Erweka серии 700 типа II – лопастной мешалке (Erweca GmbH, Германия), используя в качестве среды растворения хлористоводородную кислоту и изопропиловый спирт, а также их смесь. Количественное определение высвободившегося цифетрилина проводили на регистрирующем спектрофотометре Agilent Cary® 100 (Agilent Technologies, США).
Результаты. Выбраны оптимальные условия для определения высвобождения цифетрилина из таблеток 60 мг. Поскольку цифетрилин нерастворим в воде, в качестве среды растворения предложено использовать смесь хлористоводородной кислоты и изопропилового спирта в соотношении 3:2. Показано, что скорость вращения мешалки 100 об/мин обеспечивает переход нормированного количества цифетрилина в среду растворения за 45 мин. Разработана методика количественного определения цифетрилина в среде методом прямой спектрофотометрии. Оценка профиля растворения цифетрилина показала его постепенное высвобождение из таблеток, которое может быть описано линейной зависимостью в соответствии с уравнением Higuchi.
Заключение. В результате проведенных исследований разработана методика теста «Растворение» и оценен профиль высвобождения цифетрилина из таблеток 60 мг. Экспериментальные данные показали, что высвобождение действующего вещества из таблеток в выбранных условиях составляет более 80 % и соответствует требованиям Государственной фармакопеи Российской Федерации XV издания.
ISSN 1726-9792 (Online)